基本信息
- 项目名称：
- As（III）氧化菌筛选、鉴定与氧化机理分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 砷导致农田环境污染，危害人类健康。如何有效降低土壤中砷的危害，成为热点问题之一。本研究通过高浓度砷定向诱导，筛选高砷环境下可生存的优势菌株，经富集培养及解砷效能验证，寻找能有效降低砷毒害的微生物，从而获得一株具较强砷氧化能力菌株，并证明其能够有效减轻水稻受砷毒害，同时运用差异蛋白组学技术对该菌株的氧化As（III）机理进行了初步探讨。
- 详细介绍：
- 采用定向诱导技术，从高砷污染的稻田土壤中筛选、纯化、培养砷氧化菌并对其砷氧化能力进行了评价，获得了一株可将高毒性As(III)氧化为低毒性As(V)的高效菌株；研究了该菌株的最适培养条件，对菌株的形态特征进行了观察，采用16S rDNA和T-RFLP技术对该菌株进行了分子鉴定。在水培条件下对该菌株减轻水稻受砷毒害的能力进行了验证；进一步采用蛋白质组学技术初步探讨了该菌株在氧化砷过程中细菌胞内、胞外蛋白质差异表达。结果总结如下： 通过筛选，获得一株能将高毒性As(III)氧化为低毒性As(V)的菌株并命名为CRS003；该菌株的最优培养条件为：以4-羟基苯甲酸为碳源，以蛋白胨为氮源，pH值8，温度25℃时，摇床转速128 rpm。在上述培养条件下，该菌株在24h内可将培养液中95%的As(III)转化为As(V)和少量的甲基砷（MMA）。菌株CRS003为革兰氏阴性菌（弱阳性），杆菌，无鞭毛；菌株CRS003的分子鉴定结果显示，其序列同源性与Brevibacillus sp.达到100%。菌株CRS003的T-RFLP片段的数据库比对结果表明，该菌株为Brevibacillus laterosporus。 在含As(III)的水培溶液中种植水稻（明恢63、杂交稻汕优63、特优航II），验证结果表明，菌株CRS003有效减轻了As(III)对水稻秧苗的生长的影响。与对照（无As(III)无菌株菌液之培养液）相比，未添加菌株CRS003的菌液时，As(III)对三种水稻根长的抑制率分别为50.37%、56.39%、54.61%，对株高的抑制率分别为43.31%、43.97%、41.07%。而当添加了菌株CRS003的菌液后，As(III)对三种水稻秧苗根长的抑制率分别降低到22.57%、11.47%、18.20%，株高的抑制率分别降低到21.91%、11.39%、17.83%。 在氧化砷的过程中，该菌株的胞内、胞外蛋白质差异表达结果表明，胞外则检测出6个蛋白点发生上调表达，胞内检测出33个蛋白点发生上调表达，表明菌株以胞内蛋白质变化为主来实现对As(III)的氧化作用。蛋白质质谱鉴定结果表明，5个胞外蛋白质和27个胞内蛋白质获得功能鉴定，对32个相应蛋白质进行结构活性位点分析及功能查询后，胞外蛋白质涉及离子转运及信号激发等相关功能，而胞内蛋白质则涉及能量代谢及砷解毒等功能。因此通过对查询到的蛋白质进行图谱构建，提出了As(III)在该菌株胞内胞外的传输过程与解毒机理。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 砷对作物和人类健康具有毒害作用。如何有效降低土壤中砷的危害，成为各国政府和科研人员高度关注的问题之一。微生物降解重金属污染是生物修复的方法之一。该项目从稻田土壤中筛选出了一株砷氧化菌，分析了其砷氧化能力，获得了最适培养条件，观察了形态特征，进行了分子鉴定，并验证了其解砷毒害的能力，探讨了该菌株在氧化砷过程中，细菌胞内、胞外蛋白质差异表达，提出了该菌株氧化As（III）机理的假设。
科学性、先进性及独特之处
- 将高毒性As(III)氧化为As(V)及甲基砷，是降低砷对作物和人类毒害的有效方法。通过高浓度砷定向诱导，筛选高砷环境下可生存的优势菌株，经富集培养及解砷效能验证，寻找能有效降低砷毒害的微生物。研究思路清晰，技术方法合理。获得一株具较强砷氧化能力菌株侧胞短芽孢杆菌，并证明其能够有效减轻水稻受砷毒害，运用差异蛋白组学技术对该菌株的氧化As（III）机理进行了初步探讨。项目方案科学性强。
应用价值和现实意义
- 砷导致农田环境污染，经食物链传递到动物和人体，危害人类健康，因此如何有效降低土壤中砷的危害，成为各国政府和科研人员高度关注的问题之一。 微生物降解重金属污染是生物修复的方法之一，微生物修复技术直接在污染环境中开展生物修复，简便易行。该项目针对我国砷污染问题，通过筛选高氧化能力微生物菌株，切断砷从土壤到作物的传递链，有效降低砷对作物及人类危害。项目选题具重要科学意义及应用价值。
学术论文摘要
- 采用定向诱导技术，从高砷污染的稻田土中筛选、纯化及培养砷氧化菌并对其砷氧化能力进行了评价，获得了一株可将高毒性的As(III)氧化为低毒性的As(V)的高效菌株，并命名为CRS003。随后研究了该菌株的最适培养条件，即当以4-羟基苯甲酸为碳源，蛋白胨为氮源，pH值8，温度25℃，摇床转速128rpm时，该菌株在24h内可将培养液中95%的As(III)转化为As(V)和少量的甲基砷（MMA）。观察菌株的形态特征，该菌株为革兰氏阴性菌（弱阳性），呈杆状，杆菌，无鞭毛。进行分子鉴定后，其序列同源性与Brevibacillus sp.达100%，为Brevibacillus laterosporus。在含As(III)的水培溶液中种植水稻，验证结果表明，菌株CRS003能有效减轻As(III)对水稻秧苗的生长影响。 进一步运用蛋白质组学技术探讨了该菌株在氧化As(III)过程中胞内、外蛋白质的差异表达。经蛋白质质谱功能鉴定、结构活性位点分析及功能查询后，胞外蛋白质涉及离子转运和信号激发等相关功能，而胞内蛋白质则涉及能量代谢和砷解毒等功能。通过构建已查询蛋白质的图谱，推断了As(III)在该菌株胞内外的传输与解毒过程。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 参考技术： 1、末端限制性长度多肽性分析（T-RFLP）；2、毛细管电泳 - 电感耦合等离子体谱联用仪（CE-ICP-MS）；3、双向电泳（2-DE） 参考文献： [1]陈德富, 陈喜文. 现代分子生物学实验原理与技术. 北京:科学出版社. 2006:96-98. [2]GuiDi Yang, JinHua Xu, JinPing Zheng, et al. Speciation analysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. Talanta. 2009,78:471-476. [3]陆锦池, 王海斌, 陈荣山, 等. 化感水稻PI312777响应低磷胁迫的差异蛋白质组学分析. 中国农学通报. 2009,25(14):148-152. [4]Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Analytial Chemistry. 1996,68(5):850-858.
同类课题研究水平概述
- 近年来，随着煤矿能源的大量无序开采，废水、废渣的大量排放，加上含重金属农药、除草剂以及化肥等化学产品的大量施用，重金属污染已成为了一个世界性环境问题。因此，有效治理土壤砷污染已经成为各国政府及研究人员日益重视的问题。2011年3月，国务院已批准《湘江流域重金属污染治理实施方案》，未来治污资金总额将达595亿元，可见重金属污染治理问题已经势在必行。 砷虽不属于重金属，但行为、来源以及危害都与重金属相似，故通常列入重金属类进行讨论。首例As(III)氧化细菌于1918年由Green H报道。随着研究的不断进展，越来越多As(III)氧化菌被发现，研究较多的典型菌株包括：Alcaligenes faecalis NCIB 8687、Rhizobium sp.NT-26、Agrobacterium tumefaciens 5A、Herminiimonas arsenicoxydans ULPAsl、Thiomonas sp.3As，这些菌株都能够将毒性强的As(III)氧化为毒性弱的As(V)。 在生物体内砷代谢包括两个主要过程：（1）As(V)的还原过程；（2）无机砷的甲基化过程。微生物对环境中砷的氧化还原转化及甲基化和去甲基化等起主导作用, 微生物砷代谢在砷的动态循环起重要作用。国内已发现了一株细菌C13能在有氧条件下将As(III)氧化为As(V)，并鉴定了该菌株为土壤杆菌，同时发现两株细菌C8、C14，能将As(V)还原为As(III)，被鉴定为节杆菌、贪铜菌。“ars”砷离子泵作为研究比较透彻的一条解毒路径，含有该离子泵的微生物可将As(V)还原成As(III)，并在ATP酶、As(III)运输酶作用下把As(III)排出胞外，进而达到降解As(III)毒害的目的。 尽管砷氧化菌株筛选已取得重大进展，然而大部分仅限于氧化能力评价，特别是当前筛选的砷氧化菌在氧化能力评价上受限于仪器分析的灵敏度，一般只是对氧化As(III)、As(V)含量分析，并未涉及甲基化，更重要的是其氧化机理的揭示并没有明确的结论。因此，本研究从解As(III)毒的细菌筛选，并对解毒能力做了初步验证，具有较好的应用价值，而且As(III)与菌株蛋白的相互作用结果，为解析重金属离子与蛋白相互作用，进而分析As(III)转化与解毒机理，具有重大的实际意义。
