基本信息
- 项目名称：
- 细胞的温床--基于对新型细胞或组织恒温灌流实验系统的研制
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本作品针对现有微灌流技术的不足，设计出了一种机械稳定性能强、恒温效果好、结构简单、方便灌流液加入的新型细胞或组织恒温灌流实验系统。系统由核心部件细胞微灌流装置和附属部件恒温水浴箱、负压抽吸器及多通道灌流液输送管组成，可应用于新鲜分离的细胞、培养的细胞和组织切片的灌流实验。同时该系统也是一个可兼容多实验装置的实验平台，可广泛用于生物、医药等领域。
- 详细介绍：
- 在生物、医学领域，对离体的活组织细胞实验中，研究人员需要严格模拟在体环境，保持细胞或组织正常的形态学特征与机能学功能，以得到较为真实的实验结果。在生命科学研究中，细胞、分子水平领域的实验对灌流环境的要求非常高，而现行实验室的细胞微灌流装置的功能大多存在各方面不足。以膜片钳技术为例，每次记录通常要维持数十分钟的细胞稳定钳制，在记录途中细胞一旦因机械干扰而脱落，就需要重新开展实验，影响整个实验进程。 经过我们总结，已有的灌流装置主要存在以下五点不足： ①机械稳定性差。普通的灌流装置使用培养皿承载细胞，灌流液冲击到水面，使灌流液面不平稳，易扰动细胞，甚至冲走细胞。除此之外装置各部件之间非锚定连接，位置不固定，在实验过程中会发生机械振动或移位，这些因素是导致其机械稳定性差的主要原因。 ②恒温效果的维持不佳。普通的恒温灌流装置使用类似冷凝管的结构（外行恒温水，内行灌流液）。这种结构会使恒温水的热量大量散失于外界，造成温度维持效率低下；同时，若用培养皿承载细胞或组织，其与空气接触面积大，热量易散失，且无相应恒温加热器件，因此造成灌流液和灌流槽内恒温效果较差。 ③灌流装置与其他仪器的兼容性差。普通的恒温灌流装置组装随意，不具有与多种仪器进行合用的能力。因此不能满足各种类型实验的进行。 ④普通灌流装置有实验对象的局限性。例如，培养的细胞的实验后再培养、以及离体组织切片在培养皿中易受液面影响等因素会对实验对象的选择造成影响。 ⑤普通的恒温灌流装置采用培养皿承装细胞，其光学性能差，不利于对形态学的记录；且培养皿壁为竖直设计，与斜行的电极会形成死角操作区，极大的限制了操作。 基于以上原因，我们设计了一种结构简单、机械稳定性能好、方便灌流液加入、保证恒温效果维持的新型细胞或组织恒温灌流实验系统。该系统的创新点表现在如下方面： ①机械稳定性能方面，本装置的部件通过螺钉相互固定组合，同时我们通过将灌流液输送管镶嵌在金属恒温器内，排除了恒温水浴泵的机械活动导致的灌流管的震动。 ②本系统采用双恒温系统，可以同步保证灌流液温度及载物台内温度恒定。其实现方式有恒温水加热方案与恒温水加热—电加热方案。恒温水加热方案采用热介质闭合循环回路，巧妙地利用了恒温水循环，使多通道管灌流液与载物台恒温；恒温水加热—电加热方案是对恒温水加热方式的进一步改进。在恒温效果不变的情况下，该方案可避免恒温水在载物台恒温加热器中流动而产生的振动，进一步加强了整个装置的机械稳定性能。 ③我们的灌流装置与其他仪器的兼容性好。可以根据需要将装置固定在平板支架上，也可以固定在正置、倒置显微镜上。可以实现组织切片、培养于盖玻片上的细胞和新鲜分离的单细胞实验的稳定灌流。同时在显微镜装有摄像系统的条件下，可以通过监视器施行微操作，也可同步获得形态学和影像学资料。例如可识别绿荧光蛋白转染的细胞，或进行钙成像实验等。 ④本系统核心部件——细胞微灌流装置采用光学盖玻片承载细胞，光学性能好，可以根据实验需要方便更换细胞，同时实验后可取出细胞进行再培养，再观察。另外，灌流速度和液面高度可以根据实验需要而人为调控。进行组织切片实验时，降低液面可以减少组织切片漂浮；加快灌流速度的同时在灌流液中充入氮气即可降低细胞外环境的含氧量，由此可构建缺氧实验模型。除此之外，灌流槽的大小可更换，可以根据实验的需要以及药品量的需要进行选择大小型号不同的配套灌流槽。节省了实验的成本和消耗。 ⑤灌流槽外缘浅中间深的斜坡设计，可以方便电极置入，且不留死角，避免出现操作盲区。同时斜坡设计可防止灌流液滴入过程中对液面造成的波动，使液面更好的维持稳定。 综上所述，本作品作为一种可应用于新鲜分离的细胞、培养的细胞和组织切片的灌流实验，应用前景广泛，可运用于如胞浆钙成像，测量胞浆内的钙浓度；进行心肌细胞的动作电位和收缩力的同步记录，即电生理活动和机械活动的同步记录；通过本系统结合膜片钳技术可提取单细胞胞质，进行单细胞real-time RT-PCR技术；通过本系统可以记录胚胎心脏或心肌片、脑片的表面电位；通过本系统还可以进行缺氧的实验。因此，本系统是一个优点众多、实用性强、成本较低、可兼容多实验装置的实验平台，推广后必将为于生物、医学等研究领域的科研工作者带来很大的便利。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 作品设计、发明目的以及基本思路： 目前国内外使用到的膜片钳灌流装置的机械稳定性、恒温效果、多装置兼容性、实验对象选择性和光学性能普遍较差。为了克服这些问题，我们设计出一种由螺钉连接各组件的机械稳定性能强的细胞微灌流装置，用光学性能好的盖玻片代替培养皿承载细胞或组织以获取更好的光学效果，同时还可实现细胞的实验后再培养。 创新点： ①灌流装置有很强的机械稳定性。 ②细胞微灌流装置采用光学盖玻片承载细胞，光学性能好，同时可实现实验后再培养。 ③灌流速度可而人为调控。加快灌流速度的同时在灌流液中充入氮气即可降低细胞外环境的含氧量，由此可构建缺氧模型。 ④采用双恒温设计，可以同步保证灌流液温度及载物台内温度恒定。其实现方式有恒温水加热方案与恒温水加热—电加热方案。 ⑤灌流槽的大小可以根据实验的需要以及药品量的需要进行选择。节省了实验的成本和消耗。 ⑥灌流槽外缘浅中间深的斜坡设计，可以方便电极置入，且不留死角，避免出现操作盲区。同时斜坡设计可防止灌流液滴入过程中对液面造成的波动，使液面更好的维持稳定。 技术关键： 本系统中主要技术关键在于微灌流装置的载物台的制作。在该载物台的制作过程中要求有高精密的制作仪器，以保证各部件之间契合良好，不留缝隙、不松动。同时载物台的定位台下方的硅胶圈的制作也需要高精密的仪器完成，否则会影响密封性能，导致灌流液外漏。 技术指标： 以膜片钳实验为例，在实验过程中，钳制住细胞后60min内细胞不发生任何移动，且液面无波动。
科学性、先进性
- 作品科学性： 1.利用新型细胞或组织恒温灌流实验系统结合膜片钳技术研究了小鼠胚胎心肌细胞的Na+ 和If 通道的分子表达和功能表达的发育依赖性变化。目前已完成两篇SCI论文，其中一篇已收稿于Circulation Journal 杂志，另一篇正在审稿中，这证明了该装置的科学性和可靠性。 2.本系统可运用于生命科学各领域中急性分离细胞、培养细胞和离体组织切片的恒温灌流实验，该系统可极好的保证细胞或组织切片的生理活性，从而保证了实验的进行。 3.本系统尤其适用于通过膜片钳技术研究细胞离子通道，能够长时间稳定维持微电极与细胞之间形成的高阻封接。改善了目前国内外膜片钳灌流装置中的诸多现存不足。 作品先进性： 根据文献报道，我们对比了国内外已有的恒温灌流装置，并结合教育部科技查新工作站Z03的201136000Z03E092号报告，可知本系统的研究方法和技术达到国际先进水平，且目前在国内外尚无类似装置存在。
获奖情况及鉴定结果
- 1.本作品在2011年湖北省第8届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛中获特等奖。（附件3） 2.本作品的相关研究论文《Molecular and functional changes in voltage-gated Na+ channels in cardiomyocytes during mouse embryogenesis》被Circulation Journal 杂志收录。（该杂志2010年影响因子为2.692；收稿通知见附件11） 3.根据教育部科技查新工作站Z03的201136000Z03E092号报告，可知本作品和研究内容在国内外处于领先地位。（附件4） 4.中国科学院韩济生院士，德国国家科学顾问、欧盟干细胞研究首席科学家、德国干细胞研究协会主席、中国国务院学位委员会批准的“名誉博士”、“海外名师项目”获得者Juergen Hescheler 教授为本作品给予了高度评价。（附件5-6） 5.北京理工大学生命科学院、北京现代生物医药技术重点实验室、苏州大学医学生物技术研究所、哈尔滨工业大学生物医学工程中心对本作品进行了试用，并提供了相关鉴定证明（附件8—10）。同时，本团队已和成都泰盟科技有限公司达成初步协议，为本作品进行产业化推广（附件7）。
作品所处阶段
- 本作品处于中试及产业化协商阶段。
技术转让方式
- 技术入股，保留自主知识产权。
作品可展示的形式
- 实物、图片、视频、装置图、现场演示等。
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 该作品是精密机械加工装置。部件之间用螺钉固定，灌流管镶嵌在导热金属凹槽中，防震性能很强；灌流液和灌流槽双恒温，灌流液流出管口至灌流槽距离短，可避免室温的影响；可更换承载培养细胞的盖玻片，使组织片、分离和培养细胞灌流都成为可能；所有部件均可消毒，标本可再培养并做后续实验；可通过多通道灌流管同步灌流多种药品；液面深度人为可调；光学玻璃为槽底，通过摄像系统可进行图像监测和照相；灌流槽有不同规格，小型号适用于昂贵药品或缺氧的灌流；系统可安装于支架、正置或倒置显微镜上使用；灌流槽的斜坡设计，方便探头置入，避免出现操作盲区。本作品适用于生命科学领域的活组织切片和单细胞水平的灌流实验。可在同一组织或同一细胞上进行以下不同的研究：膜片钳-跨膜电位-表面电位-钙成像-取胞浆液做单细胞PCR-细胞染色照相-同步测定肌肉收缩。所以该装置有广泛推广前景。技术性方面对加工工艺要求较高，我们在国内公司试制已成功。直接经济效益是提供给大学、研究所、制药学、畜牧业等使用。间接经济效益是在生命科学领域产生的的研究成果。
同类课题研究水平概述
- 国内研究水平概况： 根据教育部科技查新工作站Z03的201136000Z03E092号报告（附件4）的查新结论可知，国内仅存在少数对细胞恒温灌流技术的相关研究，且各科研单位并未形成统一的恒温灌流系统标准，装置效能参差不齐。而本课题的研究内容在国内外均未见相同报道，只见于本团队所在的实验室。 在细胞恒温灌流领域，国内大多数实验室采用的是灌流槽和培养皿，其机械稳定性和光学性能与我们所用的系统相比较差，且不利于与倒置显微镜配合使用。 在2008年，钟平研制了一种较为稳定、高效的四通道灌流系统(简称STD-1型灌流系统)。此种灌流装置具有灌流速度快，浴槽中液面较为平稳等优点，但较我们设计的新型细胞或组织恒温灌流实验系统，主要有以下明显不足： 1.设备机械稳定性差。装置没有机械固定组件，易受外力影响。 2.灌流温度控制能力差。此设备缺乏载物台控温组件，实验仅限在室温（20-24°C）条件下进行，难以模拟体内环境。 3.装置光学性能较差。其使用浴槽承载细胞，不利于实验的形态学记录。 赵玉峰等人于2010年申请了两项关于细胞恒温灌流装置的国家专利，其中一项专利名为“一种细胞恒温灌流装置”，其将灌流管卷曲缠绕内置于水浴箱内，灌流管入口连接灌流给药装置；灌流管出口连接灌流槽；水浴箱通过循环水管联通恒温水循环泵。与本系统类似的是，它同样使用了恒温水循环装置，但是较本系统而言，仍存在一定不足，如下所示： 1.灌流温度控制能力较差。此装置没有载物台控温组件，恒温效果相对不足。 2.装置光学性能较差。其使用培养皿承载细胞，不利于实验的形态学记录。 3.灌流通道数目单一。其采用单通道灌流方法，只能在同一时间灌流一种液体。 除此以外，此专利缺乏对机械稳定性的详细报道。 国外研究水平概况： 目前美国Warner公司的一款恒温系统TC-324B/TC-344B型单/双温度控制器是目前国际上应用于膜片钳技术的最先进恒温灌流系统。但是与我们的发明相比，此款装置的附属部件无相应的固定装置，其机械稳定性能较差，且无多通道灌流功能，同时价格昂贵，性价比较低，不利于在国内进行广泛推广。
