基本信息
- 项目名称：
- 新型可重复使用质粒提取试剂盒
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 能源化工
- 大类：
- 科技发明制作B类
- 简介：
- 该试剂盒包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液和菌体裂解液。本项目采用由聚合物形成的整体床型质粒纯化柱与该质粒纯化柱配备的系列溶液提取质粒。整体床型质粒纯化柱制备简单、传质性能好、耐污染能力强、质粒提取过程方便快捷，且多次提取质粒样品而纯化柱性能无明显改变。本发明有效克服了现有质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、价格昂贵以及无法重复使用的缺陷。
- 详细介绍：
- 基因治疗的研究和基因疫苗的开发被认为是人类医学史上的两大突破。基因治疗就是将有治疗价值的基因构建到特定的载体中，再导入到人的体细胞中，纠正人体自身基因结构或功能上的紊乱，或抑制外源致病遗传物质的复制，达到治疗的目的。DNA疫苗也是通过将抗原基因导入到人体细胞中，在抗原侵犯时能产生能够抵制抗原的抗体，而达到预防疾病的目的。DNA疫苗因其具有能够有效诱导细胞和体液免疫反应、技术通用性强、研发周期短、生产和运输成本低等优点,在病毒性、细菌性、寄生虫疾病、肿瘤和变态免疫反应的预防和治疗等领域显示了良好的应用前景,被称为“第三代疫苗”。 有效的基因治疗必须先把治疗核酸高效地传递到靶细胞中，根据基因导入载体的不同，目前的基因治疗分为病毒载体和非病毒载体两种。病毒性载体的基因治疗通常采用改造过的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒等。由于病毒性载体的毒性和抗原性，其使用可能激活肿瘤基因或使肿瘤抑制基因失活，因此利用病毒性载体会引起安全和免疫调节方面的担忧，在目前的报道中，发现6起死亡事件，都是在使用病毒载体之后得了突发性疾病而死。 质粒是染色体外可以进行自我复制的遗传元件，广泛存在于各类生物体的细胞中。质粒是非病毒载体中最有前途的一种。当质粒内插入具有治疗作用的目的基因及所有的调控元件，即有可以用于哺乳细胞的转染。质粒相对于病毒性载体，具有低免疫反应、安全稳定、低成本、适合工业生产等优势。 近年来，随着基因治疗和DNA 疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗方面显示了突出的优势，质粒逐渐成为基因治疗的最重要的基因传递系统，应用于基因治疗的药用质粒的提取技术的发展目前已成为该领域研究的重点之一。这进一步促进了高纯度质粒提目前常见的质粒提取方法有SDS碱裂解法，煮沸法，酚仿有机抽提法，层析法，沉淀法等。然而这些经典的技术不是快速的，它们需要作若干步操作和材料与试剂的转移，这些不容易做到自动化，也不适合用于纯化药用质粒。此外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康。 质粒提取试剂盒因操作方便、提取效率较高成为质粒提取最常用的方法。20世界90年代以来，商品化的质粒提取试剂盒已经非常普遍。试剂盒通常采用碱裂解结合质粒纯化柱分离纯化的方法提取质粒。试剂盒的主要生产厂家有Qiagen、Promega、Life Technologies、Stratagene和Nest Group等国外公司，以及Tiangen和博大等国内公司。目前试剂盒中选用的质粒纯化柱材料通常为硅胶，其分离原理是利用质粒与硅胶的吸附作用纯化质粒，相互作用依赖于DNA的碱基组成和拓扑学结构，但该材料的吸附性能会受到片段长度的影响。一般硅胶材料会制成球形，制备过程中除了包括球形粒子制备步骤外，还需要筛分粒径适应的粒子，同时还会受到柱装填技术的影响。而质粒吸附材料一般采用碱再生，而常用的硅胶型吸附材料由于在碱性环境下会溶解，而难以重复使用。目前使用的高纯度质粒纯化柱主要是国外公司出产的Qiagen等进口试剂盒，质粒提取成本非常高。 针对目前质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低，通常采用的硅胶材料无法重复使用，而且该产品主要依靠进口，价格昂贵。本项目目的是提供一种提取质粒纯度高、可重复使用的大幅度降低质粒纯化操作成本的试剂盒。 将含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂混合，得到反应混合物，其中： 交联剂与单体的的物质的量的比值为0.25~0.35； 引发剂与单体的的物质的量的比值为0.005~0.03； 致孔剂用量占反应混合物体积百分含量的40~80%； 将上述反应混合物超声混合均匀，加入塑料吸附柱管中，原位聚合形成整体床，聚合温度控制在50~70°C之间，反应时间为12~24小时； 将胺类修饰剂溶于有机溶剂，形成修饰液，利用修饰液对整体床进行改性，其中胺类修饰剂占修饰液的体积百分含量为25~75%，修饰温度控制在50~70℃之间，反应时间为12~24小时。 本新型可重复使用质粒提取试剂盒的整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和储存液。 通过红外光谱法（FTIR）分析了不同修饰时间下的整体床色谱柱，不同修饰时间下的整体床型质粒纯化柱骨架结构基本相同，且12小时以后变化不大。分析图中数据可知，3500 cm-1左右的宽而强的峰是缔合氢键的吸收峰，可见随修饰时间的增加其吸收程度增加，证明了二乙胺和环氧乙烷基反应，生成了羟基。3000 cm-1左右的峰是C-N的吸收峰，其含量随修饰时间的增加而增加；1750 cm-1左右的峰是GMA中的–C=O的伸缩震动峰，说明GMA参与了聚合反应，而且含量较多；1400 cm-1 左右的吸收峰是甲基中的CH键的吸收峰，可见其含量递增。900 cm-1左右的峰是环氧基的峰，可以看出随聚合时间的增加，其含量逐渐降低； 760 cm-1左右的峰来自TAIC的环，其峰高随修饰时间的增加有所下降。 通过元素分析法测定了整体床的功能基团含量(以N含量为指标)随修饰时间的变化趋势，随反应时间的增加功能基团含量不断增加，但12小时以后功能基团含量增加缓慢。从而确立了整体床型质粒纯化柱的最佳修饰时间为12小时。 通过扫描电镜考察不同修饰时间下整体床的微观形貌，可以看到，聚合物主体为相互融合的球形束，其形貌随修饰时间增加整体床的微观形貌并没有发生很大改变。修饰后生成了类似渠道的微米级的大孔。 整体床的微孔分布利用BET法测定了整体床型质粒纯化柱的微孔分布（50纳米以下）情况，不同修饰时间下的整体床微孔分布类似。 利用压汞法测定整体床100纳米以上至微米数量级的孔径分布情况，不同修饰时间的整体床微米级大孔分布也类似。孔径集中于10至100微米间。整体床型质粒纯化柱中的大孔所占的比例远大于微孔。微米级大孔的百分含量很高，这在质粒分析的传质过程中非常重要。 根据紫外分光光度计A260和A280的吸收值，可以确定质粒产品的浓度和纯度。若A260 /A280的比值在1.8左右，则说明产品中蛋白质含量较低，质粒纯度高。 PGDT试剂盒提取质粒样品紫外风光光度计检测结果计算A260 /A280值为1.7355，说明样品中质粒纯度较高。 新型可重复使用质粒提取试剂盒最大优势在于其可重复使用，整体床型质粒纯化柱通过再生后能够再次用于提取质粒。实验中，对同一根整体床型质粒纯化柱重复使用5次，对其质粒提取效果进行评估。 新型可重复使用质粒提取试剂盒重复使用5次紫外分析结果，可以看出，经过5次提取质粒，样品紫外分析结果波动很小，重复性很高。 进一步对紫外结果分析，求出重复使用5次所得样品A260/A280，如表4所示。 表8 新型可重复使用质粒提取试剂盒重复使用5次紫外分析结果 循环使用次数 A260/A280 1 1.803822 2 1.810356 3 1.735536 4 1.731163 5 1.703916 由表8可知，利用新型可重复使用质粒提取试剂盒重复使用5次所提质粒样品A260/A280基本稳定在1.8附近，表明PGDT试剂盒循环使用效果良好。表8中数据显示，随着提取次数的递增，A260/A280的值在逐渐减小，但总体上变化不大。 进一步利用离子交换高效液相色谱对PGDT试剂盒重复5次所提取质粒样品的重复性进行检测，得到离子交换高效液相色谱分析结果，可以看出，重复使用5次后，所提取质粒在离子交换高效液相色谱分析中的出峰时间及位置基本一致，说明重复使用5次所提取质粒纯度基本保持一致。重复使用5次，质粒峰高随重复次数增加而降低，说明随着使用次数的增加，所提取的质粒浓度在逐渐递减，但波动不大，重复性良好。 利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、离子交换高效液相色谱等分析方法对新型可重复使用质粒提取试剂盒试剂盒和美国公司大品牌Qiagen试剂盒所提取质粒样品进行分析，比较两者效果可以看出，PGDT试剂盒与Qiagen试剂盒所提取质粒在琼脂糖凝胶电泳分析中几乎没有差异。图13中紫外分析结果中，A260/A280的值分别为QIAGEN：1.673165；PGDT：1.735536，两者差别很小，在某种程度上，新型可重复使用质粒提取试剂盒所提取质粒的蛋白质含量要较Qiagen少，纯度更高。 进一步由图13中两种试剂盒所提取的质粒离子交换高效液相色谱分析结果可以看出，两种试剂盒提取的质粒样品的出峰时间和位置非常接近，表明两种试剂盒提取的质粒样品纯度相当。从质粒峰高角度，新型可重复使用质粒提取试剂盒所提取质粒样品的峰高要比Qiagen样品高，表明新型可重复使用质粒提取试剂盒提取浓度较Qiagen高，效果更好。 本新型可重复使用质粒提取试剂盒与现有技术中质粒提取试剂盒相比，具有以下优点及突出性效果：该种类型的试剂盒采用由聚合物形成的整体床型质粒纯化柱，该纯化柱具有制备简单，传质性能好，耐污染能力强，可以多次提取质粒样品，而纯化柱性能无明显改变等优点。本试剂盒可重复使用，质粒提取过程方便快捷，成本低和提取样品纯度高，因此有效克服了现有质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、价格昂贵以及无法重复使用的缺陷。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 作品设计、发明目的和基本思路：针对目前质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低，通常采用的硅胶材料无法重复使用，而且该产品主要依靠进口，价格昂贵。本项目目的是提供一种提取质粒纯度高、可重复使用的大幅度降低质粒纯化操作成本的试剂盒。 创新点：新型可重复使用质粒提取试剂盒采用由聚合物形成的整体床型质粒纯化柱，该纯化柱具有制备简单，传质性能好，耐污染能力强，可以多次提取质粒样品，而纯化柱性能无明显改变等优点。本试剂盒可重复使用，质粒提取过程方便快捷，成本低，提取样品浓度高，有效克服了现有质粒提取试剂盒成本高、质粒提取纯化柱制备复杂、材料传质性能差、利用率有效、容量低、价格昂贵及无法重复使用的缺陷。 技术关键和主要技术指标：本项目所发明的新型可重复使用质粒提取试剂盒，包括质粒纯化柱、质粒纯化柱配有的系列溶液和菌体裂解液，所述的质粒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱；整体床型质粒纯化柱配有的系列溶液包括平衡液、清洗液、洗脱液、再生液和储存液；菌体裂解液采用现有技术中通常采用的碱裂解液，包括重悬液、碱液、中和液和RNAse酶液。 利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、离子交换高效液相色谱等分析方法对PGDT试剂盒和Qiagen试剂盒所提取质粒样品进行分析，比较两者效果。本新型质粒提取试剂盒与Qiagen试剂盒所提取质粒在琼脂糖凝胶电泳分析中几乎没有差异。本新型质粒提取试剂盒所提取质粒的蛋白质含量要较Qiagen少，纯度更高。
科学性、先进性
- （1）本新型质粒提取试剂盒纯化柱采用整体床型质粒纯化柱，为含有环氧端基的甲基丙烯酸酯类单体或含有环氧端基的丙烯酸酯类单体与交联剂、致孔剂和引发剂聚合所得。该整体床型质粒纯化柱可重复使用、能够大幅度降低质粒纯化操作成本、制备过程简单、亲水性能好、传质性能优良、利用率高、背压低、提取质粒纯度高。 （2）该质粒纯化柱采用原位聚合的方式合成，相比于传统质粒纯化柱的球形材料，避免在制备过程中除了包括球形粒子制备步骤外，还需要筛分粒径适宜的粒子，同时还会受到装填技术的影响，更容易实现大规模生产质粒的要求。 （3）本新型质粒提取试剂盒成功实现了可重复使用，为国内首创，具有自主知识产权，符合当前节能减排的方针政策。
获奖情况及鉴定结果
- 本项目已成功申请 2009国家大学生创新性实验计划（获一万元项目经费支持） 本项目已申请2009 - 2010年度SRT挑战杯专项（获一千元经费支持） 参加校级“挑战杯”，荣获二等奖、最佳创意奖 Yuxiong Huang, Lin Jin and Minlian Zhang. A novel type of plasmid purification kit: PGDT plasmid kit. 1st Annual World Congress of NanoMedicine-2010, Beijing, p408; 靳琳，黄宇雄，张敏莲. PGDT型质粒提取试剂盒. 第六届全国化学工程与生物化工年会，长沙，p296
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 实物
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 使用说明及该作品的技术特点和优势 质粒纯化柱采用新型材料PGDT，制备简单，成本低廉； 质粒纯化柱实现了重复使用，性能稳定； 质粒提取过程方便快捷，成本低，提取样品浓度高； 可规模化、产业化，成批操作，带来可观经济效益。 适应范围：质粒提取是分子生物学和药用质粒研究领域常见的操作。 （1）满足分子生物学实验要求 所提取质粒可用于常规的分子生物学实验，如酶切，PCR，转染等 （2）质粒作为基因治疗的最重要的基因传递系统 以质粒为传递载体的基因治疗和DNA疫苗，可用于癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗 推广前景：本项目所发明的新型质粒提取试剂盒，可进一步运用于药用质粒的规模制备下游纯化产业，实现大规模药用质粒的纯化、分离、分析的集约化生产路线。
同类课题研究水平概述
- 质粒提取是分子生物学和药用质粒研究领域中常见的操作。近年来，基因治疗和DNA 疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗方面显示了突出的优势，其应该研究正日益发展。目前质粒逐渐成为基因治疗的最重要的基因传递系统，应用于基因治疗的药用质粒的提取技术的发展目前已成为该领域研究的重点之一。这进一步促进了高纯度质粒提取技术的发展。 目前常见的质粒提取方法有SDS碱裂解法，煮沸法，酚仿有机抽提法，层析法，沉淀法等。然而这些经典的技术不是快速的，它们需要作若干步操作和材料与试剂的转移，这些不容易做到自动化，也不适合用于纯化药用质粒。此外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康。 质粒提取试剂盒因操作方便、提取效率较高成为质粒提取最常用的方法。20世界90年代以来，商品化的质粒提取试剂盒已经非常普遍。试剂盒通常采用碱裂解结合质粒纯化柱分离纯化的方法提取质粒。试剂盒的主要生产厂家有Qiagen、Promega、Life Technologies、Stratagene和Nest Group等国外公司，以及Tiangen和博大等国内公司。目前试剂盒中选用的质粒纯化柱材料通常为硅胶，其分离原理是利用质粒与硅胶的吸附作用纯化质粒，相互作用依赖于DNA的碱基组成和拓扑学结构，但该材料的吸附性能会受到片段长度的影响。一般硅胶材料会制成球形，制备过程中除了包括球形粒子制备步骤外，还需要筛分粒径适应的粒子，同时还会受到柱装填技术的影响。而质粒吸附材料一般采用碱再生，而常用的硅胶型吸附材料由于在碱性环境下会溶解，而难以重复使用。目前使用的高纯度质粒纯化柱主要是国外公司出产的Qiagen等进口试剂盒，质粒提取成本非常高。 目前质粒纯化材料往往是针对蛋白设计，其孔径较小，质粒通常无法进入分离材料的孔道。因此，前期的质粒纯化柱存在质粒提取成本高、制备复杂、材料传质性能差、利用率有限、容量低、难以重复使用等缺陷。
