基本信息
- 项目名称：
- H9亚型禽流感病毒快速诊断技术研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 禽流感是禽类烈性传染病之一，家禽在感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致并引起高死亡率及产蛋率严重下降。给家禽养殖业带来巨大损失。本作品通过建立RT-LAMP反应体系、结果可视化技术研究及临床应用等试验，成功地建立了一种H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，极大地所淡了诊断耗时，为该病的早期诊断提供了便利。该方法具有灵敏、简单、快速、直观，无需复杂仪器的特点，合适在基层兽医中推广应用。
- 详细介绍：
- 禽流感是禽类烈性传染病之一，家禽在感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致并引起高死亡率及产蛋率严重下降。给家禽养殖业带来巨大损失。本作品通过建立RT-LAMP反应体系、结果可视化技术研究及临床应用等试验，成功地建立了一种H9亚型禽流感病毒的快速检测方法，极大地所淡了诊断耗时，为该病的早期诊断提供了便利。该方法具有灵敏、简单、快速、直观，无需复杂仪器的特点，合适在基层兽医中推广应用。 本作品经敏感性试验，确定RT-LAMP方法比RT-PCR方法敏感性的10倍。两种方法均有很好的特异性。针对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子的检测结果表明，RT-LAMP方法检出率明显高于PCR方法。 与传统RT-PCR方法相比，本作品中使用的RT-LAMP方法不仅具有高敏感性，更为重要的是该方法可极大的节约检测耗时。传统RT-PCR需要将样本RNA反转录成cDNA后再应用于检测，即使在近年使用较多的一步法RT-PCR，也需在反应初期进行约30分钟的反转录步骤。而RT-LAMP只需在反应体系中加入反转录酶，即可在等温条件下一步实现样本RNA扩增，总反应仅耗时60分钟，较RT-PCR方法节省至少90分钟。 RT-LAMP检测结果的判定方法主要分为四类，一是利用凝胶电泳观察“梯形”条带的生成，二是使用实时浊度仪进行实时监测，三是肉眼观察反应管内是否产生白色浑浊，四是应用荧光显色剂显色进行判定。但前两种方法需要特殊试剂与仪器设备，而利用肉眼观察浑浊度则存在反应管透明度及人为因素等影响结果的判定。目前有较多的RT-LAMP反应使用SYBR Green I 染色剂作为荧光显色剂，但该荧光显色剂必须在反应结束后打开反应管加入，因而易造成核酸气溶胶污染，影响检测结果的准确性。 本作品中使用钙黄绿素与锰离子的混合溶液作为荧光指示剂，可通过观察颜色变化直接判定反应结果。另外，由于整个反应过程和检视过程中不需要开盖，较好地避免了因气溶胶污染而引起假阳性结果。 除上述内容外，本作品还有很大的发展空间，使其更易于基层使用。例如在此基础之上，使用FTA卡或沸水浴方法快速提取H9亚型禽流感病毒核酸，可节省样本前处理时间2-3小时，并且无需有毒有害试剂与低温高速离心机等仪器，操作简单。另外，还可对反应试剂的组成与贮存条件进行探究优化，建立一套较为完善简易的H9亚型禽流感诊断试剂盒，推广至技术、条件相对落后的基层实验室和养殖场使用。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 禽流感是养禽业重要传染病之一，H9亚型禽流感可导致高发病率和死亡率。仔鸡易感染造成死亡，产蛋鸡产蛋率明显下降，造成经济损失。项目组期望建立一种能够快速、精确、简便，适合基层应用的用于该病的快速诊断方法。 Notomi等发明了一种新的核酸扩增方法。该方法可在等温条件下高效扩增靶基因，拥有较高的敏感性及特异性。此外，只需简单的恒温设备即可进行检测，加之简便的可视化技术使其适合基层推广应用。
科学性、先进性及独特之处
- 1、使用含有6条引物的反转录环介导等温扩增方法对H9亚型禽流感病毒进行检测，恒温扩增，无需反转录过程，一步反应即可。检测耗时仅需60分钟，与传统检测方法相比，节省大量检测耗时。 2、在检测反应液中直接加入荧光显色剂进行实时检测，或者根据反应液颜色的变化判定反应与否，简单直观。 3、操作简单，快速简便，成本较低，适合基层推广应用。
应用价值和现实意义
- 中国大陆自94年首次分离到H9亚型禽流感病毒后，该病开始广泛流行，导致高死亡率及产蛋率严重下降，对养禽业造成经济损失。并有关于人感染该病毒的报道。早期诊断是疫病防控的关键，因此如能针对发病禽类进行快速诊断，及时切断传染源，就显得尤为重要。 本作品建立的诊断方法，不仅具有灵敏、简单、快速、直观，无需复杂仪器的特点，而且检测成本较低。此外，若配合简化的样本处理方法，将会更加适合在基层兽医中推广应用。
学术论文摘要
- 利用反转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP），建立了一种特异、灵敏、便捷，H9亚型禽流感病毒的检测方法。该方法使用6条特异引物，在63℃的等温条件下进行反应，敏感性是RT-PCR方法的10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的检测表明，该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与锰离子的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测表明，RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。 通过该研究，我们获得了一套较为完整的针对H9亚型禽流感病毒的检测方法，具有灵敏、简单、快速、直观的特点。成本较低，适合基层推广应用，并有助于该病的早期诊断，便于该病防控。
获奖情况
- 1、“H9亚型禽流感病毒环介导温扩增检测方法的建立与荧光显色剂的应用”一文，已于2010年6月被中国科技核心期刊《农业生物技术学报》接受，并于2011年第19卷第1期发表。 2、“H9亚型禽流感病毒快速诊断技术研究”做为全国91个参展项目之一，参加了2010年9月25日由教育部高教司主办，大连理工大学承办的“第三届全国大学生创新论坛”。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1、LAMP技术及其在微生物检测中的应用，鞠慧萍等，上海畜牧兽医通讯,2010 2、荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用，张跃伟等，农业生物技术学报,2010 3、环介导等温扩增（LAMP）技术的应用研究，刘永生等，中国农学通报,2010 4、猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用，李佳禾等，农业生物技术学报,2009 5、环介导等温扩增技术在动物病原检测中的应用，何玲等，广东畜牧兽医科技,2009 6、环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用，刘宝山等，中国兽医杂志,2009
同类课题研究水平概述
- 1、目前国内外大量研究均使用SYBR Green I 染色剂作为荧光显色剂应用于LAMP方法检测，但该方法存在操作复杂，易造成核酸产物污染的缺点，影响检测结果的准确性。本研究使用钙黄绿素与锰离子的混合溶液作为结果指示剂，仅需在反应前加入试剂，通过反应后观察颜色变化即可判定检测结果，有效的避免了上述问题。 2、除本作品完成人在中国科技核心期刊《农业生物技术学报》发表的一篇论文外，国内目前未见相关研究报道，该方法在H9禽流感病毒诊断方面还未开始应用。 3、针对H9亚型禽流感病毒，目前国外仅见一篇英文文献报道——Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of H9 avian influenza virus。该文献中使用4条引物进行反应，且不包含荧光指示剂的应用，诊断过程复杂繁琐。而本研究使用6条引物进行反应，可大大提高反应效率；加上显色剂的应用，是检测结果肉眼可见，极大的缩短了检测耗时。 4、与目前使用较多的PCR方法相比，该方法省去了单独的反转录过程，且恒温反应，操作简便，无需复杂昂贵的设备，同时保证了方法的特异性与敏感性。 5、综上所述，该方法灵敏、简单、快速、直观，适合基层推广应用，并有助于该病的早期诊断，便于该病防控。
