主办单位: 共青团中央   中国科协   教育部   中国社会科学院   全国学联  

承办单位: 贵州大学     

基本信息

项目名称:
正交法优选离子交换纤维分离纯化多糖的最佳条件
小类:
生命科学
简介:
离子交换纤维作为新型的纤维状交换材料,具有许多颗粒状交换剂所不具备的优点。在中药提纯程序中分离纯化是非常关键的一道工序,离子交换纤维具有比表面积大、传质距离短,而且具有吸附和解吸速度快、再生能力强、能耗低、流体阻力小等优点,所以用离子交换纤维代替大孔树脂来研究分离纯化中药具有非常现实的意义。 本课题利用正交法优选强碱性阴离子交换纤维对银杏叶多糖分离纯化的最佳条件,这为中药生产提供了参数。
详细介绍:
正交法优选离子交换纤维分离纯化多糖的最佳条件 张红梅 一、实验目的: 离子交换纤维作为新型的纤维状交换材料,具有许多颗粒状交换剂所不具备的优点。在中药提纯程序中分离纯化是非常关键的一道工序,目前常见的交换吸附材料是大孔树脂,而离子交换纤维具有比表面积大、传质距离短,而且具有吸附和解吸速度快、再生能力强、能耗低、流体阻力小等优点,所以用离子交换纤维代替大孔树脂来研究分离纯化中药具有非常现实的意义。 正交法是科学研究常用的方法,具有省时、高效的特点,了解和掌握该方法对于以后学习和科研具有一定的益处。 本实验利用正交法优选强碱性阴离子交换纤维对银杏叶多糖分离纯化的最佳条件,这为中药生产提供了参数。 二、实验原料、药品及仪器 实验原料:银杏叶;强碱性阴离子交换纤维(自制,交换容量为2.92mmol/g)。 实验药品:葡萄糖、6%的苯酚溶液、乙醇、盐酸、氢氧化钠、浓硫酸。 实验仪器:FZ102型微型植物粉碎机、40目标准检验筛、ALC-210.4型分析天平、DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥器、DFZ-6050型真空干燥箱、BKH-BC型玻璃仪器快速烘干器、YZ1515X恒流泵、秒表、UV-9600型紫外可见分光光度计、1.4型恒温水浴锅。 三、实验步骤 (1)原料的预处理 ①银杏叶预处理 将银杏叶表面的杂质洗净并烘干,用FZ102型微型植物粉碎机粉碎并用40目标准检验筛过目,放入DFZ-6050型真空干燥箱中,经60℃真空干燥4h。 ②强碱性离子交换纤维的预处理 将离子交换纤维置于1mol/L氢氧化钠溶液中浸泡12h后取出,用蒸馏水清洗,直至中性;再将纤维在1mol/L盐酸溶液浸泡12h,同样洗至中性;再将纤维在1mol/L氢氧化钠溶液浸泡12h,同样洗至中性;最后将纤维在无水乙醇中浸泡24h,使其充分溶胀,然后用蒸馏水洗至无醇味,干燥备用。 (2)多糖标准曲线的绘制 ①葡萄糖最大吸收峰的测定 配置0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液,准确移取2mL浓度为0.1mg/mL的葡萄糖溶液至试管中,先后加入1mL6%的苯酚溶液和5mL浓硫酸显色30min,用紫外可见分光光度计进行全波长扫描(380nm~800nm),检测其在不同波长下的吸光度,确定出最大吸收波长。 ②葡萄糖标准曲线的绘制 按梯度准确移取上述0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液0.000mL、0.010mL、0.025mL、0.040mL、0.050mL、0.075mL、0.100mL于7只5mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,放置几分钟后,分别取2mL于试管中,先后加入1mL6%的苯酚溶液和5mL浓硫酸显色30min,以蒸馏水为参比液,在488nm处(即最大吸收波长)测各自的吸光度。以葡萄糖标准液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准工作曲线,并求得回归线方程。 (3)恒流泵工作曲线的绘制 用一个150mL的烧杯装上适量去离子水,将恒流泵试管的一端没入去离子水中,用量筒在试管的另一端接流出液,当试管中无气泡时开始收集流出液并用秒表计时,准确测定恒流泵在不同转速下一分钟内收集的去离子水的体积。用转速和收集的流出液体积作图,绘制恒流泵工作曲线。 (4)饱和吸附纤维的制备 准确称取3g处理好的强碱阴离子交换纤维放入250mL的锥形瓶中,加入100mL浓度为3.38mg/mL的银杏叶多糖溶液,调节pH值为4,每隔一定时间振摇锥形瓶,使溶液浓度均匀。每隔一定时间测定锥形瓶中溶液浓度和pH值。随着多糖被纤维交换吸附,锥形瓶中溶液浓度和pH均降低,这时补充多糖标准液并调节pH值,直到锥形瓶中溶液浓度和pH值不再变化为止。当纤维达到饱和吸附后,滤干并用蒸馏水洗去浮在纤维表面上的多糖。计算此时最大饱和吸附量。 (5)银杏叶多糖的浸提实验 利用正交实验研究银杏叶多糖浸提的最优条件。改变浸提温度、浸提时间、pH值和液固比,设计正交实验,如表1所示。 表1浸提正交实验因素水平表 温度(A)/℃ 时间(B)/h pH(C)值 液固比(D)/(ml*g-1) 1 70 3 3 15:1 2 80 4 4 20:1 3 90 5 5 25:1 (6)静态吸附实验 利用正交实验研究静态吸附的最优条件组合。改变多糖浓度、吸附温度、pH值和液固比,设计正交实验,如表2所示。 表2静态吸附正交实验因素水平表 浓度(A)/(mg * ml -1) 温度(B)/℃ pH(C)值 液固比(D)/(ml*g-1) 1 0.54 60 3 200:1 2 0.68 70 4 250:1 3 0.81 80 5 300:1 (7)动态吸附实验 利用正交实验研究动态吸附的最优组合条件,上柱纤维质量为0.1g,改变上柱液浓度、上柱液体积、pH值和流速,设计正交实验,如表3所示。 表3动态吸附正交实验因素水平表 上柱液浓度(A)/(mg * ml -1) 上柱液体积(B)/ml pH(C)值 流速(D)/(ml*min-1) 1 0.27 10 5 0.29 2 0.41 15 6 0.47 3 0.54 20 7 0.90 (8)静态解吸实验 多糖可以溶于低浓度乙醇,本实验采用不同浓度的乙醇溶液作为解吸剂对银杏叶多糖的饱和吸附纤维进行解吸,利用正交实验研究饱和吸附纤维进行静态解吸时的最优组合条件,改变解吸温度、解析剂浓度、固液比和pH值,设计正交实验,如表4所示。 表4静态解吸正交实验因素水平表 温度(A)/℃ 浓度(B)/% 液固比(C)/(ml*g-1) pH(D)值 1 60 40 20:0.05 1 2 70 50 30:0.05 2 3 80 60 40:0.05 3 (9 )动态解吸实验 利用正交实验研究饱和吸附纤维进行动态解吸时的最优组合条件,改变流速、解析剂浓度、解析剂体积和pH值,设计正交实验,如表5所示。 表5动态解吸正交实验因素水平表 流速(A)/(ml*min-1) 浓度(B)/% 体积(C)/ml pH(D)值 1 0.12 40 20 1 2 0.29 50 25 2 3 0.47 60 30 3 四、结果与讨论 (1)标准曲线的绘制 ①葡萄糖最大吸收峰的确定 对葡萄糖标准溶液进行全波长扫描(380nm~800nm),实验测定数据如图1所示: 图1葡萄糖溶液全波长扫描(380nm~800nm) 图中葡萄糖标准溶液的最大吸收峰可作为替代多糖化合物定量分析的重要依据。根据实验结果,葡萄糖的最大吸收波长在488nm处,所以本实验选定在488nm处测定吸光度。 ② 葡萄糖标准曲线 以吸光度(A)为纵坐标,葡萄糖标准溶液浓度/(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,如图2所示: 图2葡萄糖标准曲线 由图所示,葡萄糖标准曲线在0~0.120mg/mL浓度范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系,其回归方程为y = 14.10x+0.155,R² = 0.993,可以作为实验中计算多糖化合物含量的依据。式中:y—吸光度(A);x—多糖溶液浓度,mg•mL-1。 (2)恒流泵工作曲线 以流出液的体积为纵坐标,转速为横坐标作图,实验测定恒流泵在不同转速下每分钟流出液的体积数据如图3所示: 图3恒流泵工作曲线 将工作曲线线性回归,得方程y=0.854x+0.0.113, R2=0.997。式中:y—1分钟内流出液的体积,mL/min;x—恒流泵转速,rap/min。 (3)银杏叶粉末浸提结果正交实验分析 浸提率等于提取出的提取物的质量与原银杏叶粉末质量的比值,用公式表示为: μ=M1/M0*100% 式中:μ—提取率,%; M1—提取出的提取物的质量,g; M0—原银杏叶粉末的质量,g。 银杏叶多糖浸提正交实验结果如表6所示。 表6银杏叶粉末浸提正交实验结果及分析 序号 A B C D 浸提率/% 1 1 1 1 1 8.205 2 1 2 2 2 10.300 3 1 3 3 3 9.840 4 2 1 2 3 7.535 5 2 2 3 1 9.730 6 2 3 1 2 10.085 7 3 1 3 2 10.050 8 3 2 1 3 10.015 9 3 3 2 1 10.760 k1 9.448 8.597 9.435 9.565 k2 9.117 10.015 9.532 10.145 k3 10.275 10.228 9.873 9.130 R 1.158 1.631 0.438 1.015 主次顺序 B>A>D>C 最优水平 A3 B3 C3 D2 由表6极差分析可知,影响浸提率主次顺序依次为时间、温度、液固比和pH值,最优吸附条件组合为A3B3C3D1,即温度90℃,时间为5h,pH值为5,液固比20:1。 ①随着浸提温度的升高,浸提率逐渐增大,这是由于热作用使分子运动速度加快,加快了传质作用,使细胞内的多糖容易浸出,同时热作用加大了对银杏叶的细胞壁组织进行破坏,也能使细胞内的多糖容易浸出。②液固比越大,银杏叶细胞内外的多糖浓度差就越大,这样传质推动力也越大,有利于多糖的浸出,但是当液固比继续增大时,浸提率不会无限增大,而是趋于某一极限值,此时浸提率几乎不再上升。③pH值较小时更有利于多糖的浸提,在酸性较强的条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,随着pH值的增大,浸提率逐渐下降。④浸提率随着时间的增加而上升,最后到达极值,温度高有利于可溶性成分的溶解和扩散,但温度也不宜太高,致使某些成分被破坏,杂质增多。因此,浸提时应控制适宜的温度。 (4)离子交换纤维对葡萄糖的静态吸附正交实验结果及分析 吸附率的计算: 由标准曲线的回归方程计算吸附后溶液多糖的浓度,再乘以相应体积得吸附后溶液里剩余多糖的质量,由吸附前溶液里多糖质量减去吸附后溶液剩余多糖的质量再除以吸附前溶液里多糖的质量,既得吸附率,计算公式如下: λ=(M0-M1)/M0*100% 式中: λ—吸附率,%; M0—吸附前溶液里多糖的质量,mg; M1—吸附后溶液里剩余多糖的质量,mg。 离子交换纤维对葡萄糖的静态吸附正交实验结果如表7所示。 表7离子交换纤维对葡萄糖的静态吸附正交实验结果及分析 序号 A B C D 吸附率/% 1 1 1 1 1 94.57 2 1 2 2 2 93.03 3 1 3 3 3 93.41 4 2 1 2 3 95.63 5 2 2 3 1 96.01 6 2 3 1 2 95.72 7 3 1 3 2 96.20 8 3 2 1 3 95.05 9 3 3 2 1 94.28 k1 93.670 95.467 95.113 94.953 k2 95.787 94.697 94.313 94.983 k3 95.177 94.470 95.207 94.697 R 2.117 0.997 0.894 0.286 主次顺序 A>B>C>D 最优水平 A2 B1 C3 D2 由表7的极差分析可知,对静态吸附影响最大的因素是上柱液浓度,影响最小的是溶液液固比,影响因素的主次顺序为A>B>C>D。由均值大小可知动态吸附的最优组合为A2B1C3D2,即上柱液浓度为0.68mg/mL,温度为60℃,pH值为5,液固比为250:1。 随着多糖浓度的增加,吸附量呈显著增加趋势,因为浓度越大,多糖分子与离子交换纤维交换的机率越大,所以吸附量就越大,吸附率也随之上升,当浓度较高时,纤维吸附趋于饱和。 (5)离子交换纤维对葡萄糖的动态吸附正交实验结果及分析 离子交换纤维对葡萄糖的动态吸附正交实验结果如表8所示。 表8离子交换纤维对葡萄糖的动态吸附正交实验结果及分析 序号 A B C D 吸附率/% 1 1 1 1 1 91.31 2 1 2 2 2 92.61 3 1 3 3 3 92.61 4 2 1 2 3 92.61 5 2 2 3 1 92.51 6 2 3 1 2 92.61 7 3 1 3 2 92.61 8 3 2 1 3 92.33 9 3 3 2 1 92.61 k1 92.177 92.177 92.083 92.143 k2 92.577 92.483 92.610 92.610 k3 92.517 92.610 92.577 92.517 R 0.400 0.433 0.527 0.467 主次顺序 C>D>B>A 最优水平 A2 B3 C2 D2 由表8的极差分析可知,对动态吸附影响最大的因素是ph值,影响最小的是上柱液浓度,影响因素的主次顺序为C>D>B>A。由均值大小可知动态吸附的最优组合为A2B3C2D2,即上柱液浓度为0.41mg/mL,上柱液体积20mL,pH值为6,流速为0.47 mL/min。 纤维吸附有一定的饱和值,溶液浓度较小时,其多糖含量不能满足其饱和吸附,所以吸附量呈上升趋势,吸附率也上升;随着多糖浓度增加,纤维的吸附趋于饱和,则不会无限地进行吸附,所以其吸附量会逐渐趋于一个平衡值,由于吸附量不再增加,而溶液中多糖总量不断增加,所以吸附率逐渐下降。 (6)静态解吸结果分析 ①饱和吸附纤维吸附量 银杏叶多糖主要由LGBP-A(D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-木糖)和LGBP-B(D-葡萄糖)两种单一多糖组成,平均分子量分别为11×104和2×104,分别占多糖组分的42.1%和57.9%,将两种多糖加权平均得银杏叶多糖的平均分子量为57895。强碱性离子交换纤维对银杏叶多糖的理论饱和吸附量为: q' = 57895×2.92/1000=169.05(mg/g) 吸附量的计算方法如下: q = (Mo-M1-∑Mt) /G 式中: q—静态吸附量,mg/g; Mo—溶液中银杏叶多糖起始质量,mg; M1—残液中银杏叶多糖质量,mg; ∑Mt—静态吸附过程移取的溶液中银杏叶多糖质量,mg; G—干纤维质量,g。 由公式q = (Mo –M1 -∑Mt) /G计算得出本次实验强碱性离子交换纤维对银杏叶多糖的实际饱和吸附量为168.38mg/g。 ②离子交换纤维对葡萄糖的静态解吸正交实验结果及分析 解吸率的计算: 由标准曲线的回归方程计算解吸后溶液里多糖的质量,再除以原吸附在纤维上的多糖质量,既得解吸率,计算公式如下: ν=M1/M0*100% 式中: ν—解吸率,%; M1—解吸后溶液里多糖质量,mg; M0—原吸附在纤维上的多糖质量,mg。 吸附在离子交换纤维上的葡萄糖静态解吸正交实验结果及分析如表9所示。 表9静态解吸正交实验结果及分析 序号 A B C D 解吸率% 1 1 1 1 1 90.22 2 1 2 2 2 84.66 3 1 3 3 3 79.68 4 2 1 2 3 85.36 5 2 2 3 1 91.75 6 2 3 1 2 89.68 7 3 1 3 2 83.56 8 3 2 1 3 82.06 9 3 3 2 1 89.88 k1 84.853 86.380 87.320 90.617 k2 88.930 86.157 86.633 85.967 k3 85.167 86.413 84.997 82.367 R 4.077 0.256 2.323 8.250 主次顺序 D>A>C>B 最优水平 A2 B3 C1 D1 由表9极差分析可知,影响解析率主次顺序依次为pH值、温度、液固比和解析剂浓度,最优吸附条件组合为A2B3C1D1,即温度70℃,解析剂浓度60%、固液比为20:0.05和pH值为1。 (7) 离子交换纤维对葡萄糖的动态解析正交实验结果及分析 吸附在离子交换纤维上的葡萄糖动态解吸正交实验结果及分析如表10所示。 表10动态解吸正交实验结果及分析 序号 A B C D 解吸率% 1 1 1 1 1 82.47 2 1 2 2 2 81.05 3 1 3 3 3 80.78 4 2 1 2 3 79.79 5 2 2 3 1 81.19 6 2 3 1 2 79.99 7 3 1 3 2 78.90 8 3 2 1 3 77.51 9 3 3 2 1 79.19 k1 81.433 80.387 79.990 80.950 k2 80.323 79.917 80.010 79.980 k3 78.533 79.987 80.290 79.360 R 2.900 0.470 0.300 1.590 主次顺序 A>D>B>C 最优水平 A1 B1 C3 D1 由表10极差分析可知,影响解析率主次顺序依次为流速、pH值、解析剂浓度和解析剂体积,最优吸附条件组合为A1B1C3D1,即流速0.12ml/min、解析剂浓度40%、解析剂体积30ml和pH值为1。 解吸率随着流速的增大而减小,这是因为流速越慢解吸剂与纤维床接触的时间也越长,与纤维上的多糖交换的时间也越长,解吸就越充分。 五、结论 1)银杏叶多糖的最佳浸提条件:温度90℃,时间为5h,pH值为5,液固比20:1。 2)静态吸附最佳条件:上柱液浓度为0.68mg/mL,温度为60℃,pH值为5,液固比为250:1。 3)动态吸附最佳条件:上柱液浓度为0.41mg/mL,上柱液体积20mL,pH值为6,流速为0.47 mL/min。 4)静态解吸最佳条件:温度70℃,解析剂浓度60%乙醇(体积比)溶液、固液比为20:0.05和pH值为1。 5)动态解吸最佳条件:流速0.12ml/min、解析剂浓度40%乙醇(体积比)溶液、解析剂体积30ml(纤维0.05g)和pH值为1。 参考文献 [1]原思国,曾汉民.离子交换功能纤维的研究、开发与发展[J]。高科技纤维与应用,1998,23(6):8-15. [2] 许睿,韦松.20年来中药化学成分提取分离技术的进展[J]。中成药,1006,28(11):1646-1650. [3] 夏秀华,王海鸥.银杏叶多糖提取工艺研究[J].食品研究与开发,2006,27(1): 69-71. [4]刘廷岳,聂素双,蒋亮,等.离子交换纤维对葛根素动态吸附和解析的研究[J]。中国新药杂志,2007,16(6):458-461. [5]陈群,陈永红。银杏叶多糖的分离、分析及其对小鼠腹腔吞噬细胞的影响[J]。淮南师范学院学报,2002,4(14):32-33. [6]刘丽,刘廷岳。离子交换纤维对生物碱静态吸附的研究[J].北京中医药大学学报,2008,31(12):851-855.

作品专业信息

撰写目的和基本思路

离子交换纤维是近年来发展迅速的新型纤维状吸附与分离材料。 本课题利用自制的强碱性离子交换纤维对银杏叶多糖进行分离纯化。与传统的颗粒状交换材料相比,离子交换纤维具有比表面积大、传质距离短,对有机小分子具有较高的吸附选择性,而且具有吸附和解吸速度快、再生能力强、能耗低、流体阻力小等系列优点,所以本实验选择离子交换纤维代替传统的大孔树脂来研究其对银杏叶多糖的静态和动态的吸附和解吸。

科学性、先进性及独特之处

离子交换纤维作为新型的纤维状交换材料,具有许多颗粒状交换剂所不具备的优点。在中药提纯程序中分离纯化是非常关键的一道工序,目前常见的交换吸附材料是大孔树脂,而离子交换纤维具有比表面积大、传质距离短,而且具有吸附和解吸速度快、再生能力强、能耗低、流体阻力小等优点,所以用离子交换纤维代替大孔树脂来研究分离纯化中药具有非常现实的意义。

应用价值和现实意义

高有效成分含量提取物的获得在中成药制药方面具有极其重要的意义,借此可以减小药物的体积、提高载药量、控制药物中有效成分的含量并使药效保持稳定,可大大的拓宽中药制药的创新范围和原料中间体的使用领域。离子交换纤维对分离纯化中药具有重要意义 本课题能够提供一种分离纯化多糖类化合物的方法,使得产品纯度高、杂质含量少、操作工艺简捷、生产成本低,适用于规模化生产多糖类化合物。

学术论文摘要

本课题以正交法优选离子交换纤维分离纯化多糖的最佳条件为目的。采用将银杏叶的浸提液在纤维上吸附,再用乙醇洗脱,得纯化多糖的方法。得到以下结果:离子交换纤维纯化多糖的最佳工艺,浸取银杏叶多糖的最佳条件为用pH=5的液固比20:1水中,在90℃处浸提5h; 强碱阴离子交换纤维吸附多糖的最佳条件是上柱液浓度为0.41mg/mL,上柱液体积20mL,pH值为6,流速为0.47 mL/min;吸附在强碱阴离子交换纤维上的多糖动态解吸的最佳条件是流速0.12ml/min、解析剂浓度40%乙醇(体积比)溶液、解析剂体积30ml(纤维0.05g)和pH值为1。该课题得出的结论是强碱阴离子交换纤维提纯银杏叶多糖是可行的。

获奖情况

鉴定结果

该课题得出的结论能够为今后中药的提取分离等技术的发展提供重要的参考依据。

参考文献

[1] 刘廷岳,聂素双,蒋亮,等.离子交换纤维对葛根素动态吸附和解吸的研究[J].中国新药杂志,2007,16(6):458-461. [2]刘廷岳,聂素双,彭露婷,等.离子交换纤维对葛根素静态吸附和解析的考察[J].沈阳药科大学学报,2008,25 (2):148-152. [3] 刘丽,刘廷岳.离子交换纤维对生物碱静态吸附的研究[J].北京中医药大学学报,2008,31(12):851-855. [4] 刘廷岳;聂素双;崔成民;周绍箕.离子交换纤维提取纯化黄柏总生物碱的方法[P].中国专利:200810126428,2009-12-30. [5] 刘廷岳;聂素双;崔成民;周绍箕. 离子交换纤维提取纯化葛根素的方法[P].中国专利:200810126427,2009-12-30. [6] 刘廷岳,聂素双,崔成民,周绍箕. 离子交换纤维提取纯化黄酮类化合物的方法[P].中国专利:200910087551.5,2010-5-26.

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