基本信息
- 项目名称：
- “川黄柏系列现代生物工程技术研究与示范”
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本项目通过组织培养的研究，培育出快速繁殖的川黄柏组培苗；通过细胞悬浮培养的研究，筛选出生长速度快的细胞株，提供大量次生代谢产物含量高的培养物，为工业化生产奠定基础。多倍体诱导研究，培育出器官表现出巨型性、次生代谢产物含量增加、生态适应性和对逆境的抗耐性强的新品种。转基因的研究，培养出有效药用成分含量高、在无激素的培养基上疯狂生长的毛状根，为可持续性次生代谢物生产提供一条可靠和有效途径。四川省是生物技术产业化示范省,正在实施“7+3”产业。即7个优势产业和3个潜力产业。而中药产业就是7个优势产业之一，生物工程是3个潜力产业之一。所以用生物工程技术进行中药产业开发是非常有意义。本项目采用一系列现代生物工程技术研究我国药用植物川黄柏进行示范研究，通过将这一系列现代生物工程技术普及到其他药用植物上。最终目标是实现中药现代化。
- 详细介绍：
- 1．立项背景： 川黄柏为芸香科黄柏属植物黄皮树Phellodendron Chinese Schneid.的干燥树皮。主产于四川、贵州等地。川黄柏为著名川产道地“三木”类药材之一，为国家二类保护植物。川黄柏中含有小檗碱(berberine)、黄柏碱（phellodendrine）木兰碱（magnoflorine）、掌叶防已碱（palmatine）、黄柏酮（obacunone）等。经过近几年的研发现川黄柏具有抗病原微生物、对消化系统和心血管系统的疾病具有疗效作用的药理作用。 国内市场每年对川黄柏的需求量逐年增加。据对全国17家大型药材市场及中药材原料行业每年所需用川黄柏总量估算， 2000～2001年为1000～1200吨，2006年增加至3000～3200吨左右，2008年上升至3500～3800吨，至2009年更有望抬升到5000吨。但是，经过多年砍伐剥皮，资源已经不多。目前野生川黄柏资源已稀少,四川省主要分布在平武、茂县、宝兴、雅安、美姑、一线以东盆地边缘山地。80年代,计划经济向商品经济转换,管理失控,盲目乱砍乱伐,野生资源破坏极为严重。其中大部分用于提取小蘖碱,许多幼树亦遭厄运,资源受到毁灭性破坏.针对这一现象,野生黄柏列入国家保护品种,严禁再破坏野生资源;药用必须栽培,砍伐剥皮需经林管部门审批。目前川黄柏主要来源于人工大面积栽种黄皮树.黄皮树雌雄异株,留种困难,且采用有性繁殖,其种子变异率大,难以保证品种特性,而利用扦插繁殖，插条难生根，繁殖速度慢，并且川黄柏药用树皮时,主要是使用较厚的主干及枝干皮。为此,一般应采剥生长15年以上的树皮。这种单纯从大自然中提取原材料的做法不仅已远远不能满足市场的需求，而且还破外了野生资源，使野生资源锐减。同时，在川黄柏种植过程中存在农药残留、重金属含量过高、质量不稳定等问题严重影响药材质量，在一定程度上阻碍了川黄柏的现代化研究。 本项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,旨在培育含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种，从而解决川黄柏市场供需不平衡的问题，也解决了单纯从大自然中提取川黄柏的做法，保护川黄柏的野生资源。本项目通过将这一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，其最终目的是为了让这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物研究中去，以解决目前制约我国传统中药材实现现代化面临的诸多问题。 中医药作为世界传统医药宝库中的一颗明珠,是迄今为止世界上保存得最为完整的民族医药体系,它以显著的临床疗效、浩翰的医疗文献屹立于世界医疗之林。几千年来,我国民族医药为保障各族人民的身体健康做出了不可磨灭的贡献。有专家预言,21世纪可能是中药的世纪,天然药物将会得到更快的发展。中国加入WTO后,中医药面临着一次千载难逢的好机会, 中医药必将以其特有的优势为振兴民族经济、弘扬民族文化发挥积极作用。据资料统计,目前的药品中仅有1/4来自植物,绝大部分为人体不能代谢的化学合成物质。进入21世纪,药用植物在保障人类健康的社会医疗事业中的作用越来越重要。为战胜危及人类生命的癌症、艾滋病、心脏病等严重疾病,人们正在不断从植物中寻找新药源,因为在药用植物中包含着许多人们尚未认识和开发的具有新功能的结构,其中不少有望成为新的药物。然而,许多有独特生理活性的植物天然次生产物,在植物中的含量很低,利用微生物或化学方法不能或难以合成,并且受到资源和环境条件的限制,靠采集野生资源提取很难满足需要,因此用生物工程技术来工业化生产这些中药材，实现中药现代化势在必行。生物工程技术的兴起,为我国药用植物的研究和发展提供了良机和手段。借助生物工程技术,可使濒临灭绝的药用植物资源得以保存和繁殖,保持自然界生物的多样性;将那些数量极少而又有价值的新类型化合物进行扩增,满足临床的需求。生物技术的广泛应用,将彻底改变传统药用植物生产和加工技术,使之更适合新时代的要求。 2．详细科学技术内容： 本项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导、染色体核型分析和转基因等一系列现代生物工程技术,旨在培育含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种，从而为解决川黄柏市场资源短缺的问题，同时保护川黄柏的野生资源。通过将这一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，其最终目的可以将这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物，以解决目前我国传统的中药材面临以下诸多问题。采用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导、染色体核型分析和转基因等一系列生物工程技术发展中药材生产。是积极响应四川省正在实施“7+3”产业。所以用生物工程技术进行中药产业开发是非常有意义的。 围绕项目总体目标，设置了10个研究专项。 （1）专项一：川黄柏愈伤组织诱导研究 在含有不同种类和不同浓度激素的培养基中诱导川黄柏愈伤组织，诱导出的愈伤组织为后续的实验“川黄柏成熟叶片植株再生的研究”、“川黄柏的细胞悬浮培养”和“川黄柏愈伤组织多倍体诱导研究”奠定了基础，同时也有利于今后通过组织培养直接从愈伤组织中提取小蘖碱。 （2）专项二：川黄柏成熟叶片植株再生的研究 首次建立了一套以川黄柏成熟叶片为外植体的植株再生的快速繁殖技术。研究出最佳诱导愈伤组织培养基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，诱导率均为100%；不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培养基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。随着中药材市场国际化的推进，川黄柏在药材和化妆品市场的大量应用，使得市场对川黄柏的需求量日益增加.本次研究建立的川黄柏成熟叶片植株再生的方式不仅能保持植株优良性状的稳定，而且可以迅速扩大繁殖规模，在很短的时间内为生产上提供大量优质苗木，具有重大的经济价值；同时也为进一步用叶圆盘法对其进行转基因研究创造了条件. （3）专项三：正交设计法在川黄柏组织培养中的应用 首次采用能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的正交试验法探索了4种外源激素对川黄柏诱导愈伤组织的影响, 结果显示四种激素6-BA、2.4-D、IAA、NAA对川黄柏的愈伤组织有不同的影响，它们的作用大小可表示为2.4-D>6-BA>IAA>NAA. 川黄柏愈伤组织诱导最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2.4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L. （4）专项四：川黄柏细胞悬浮培养 植物细胞悬浮培养技术是当今药用植物实现工业化生产的必经之路，目前已在红豆杉、甘草、人参和黄连等多种药物的生产中取得了成功。通过不断改善植物细胞体外培悬浮培养条件，可大大地提高生物细胞中次生代谢的含量，并且还可以通过向培养基中添加药物合成的前体物质，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有效成分的含量；另外，对悬浮培养的细胞进行特定的生物遗传转化反应，也将获得新的药物成分，从而可很好地实现了天然植物大规模工业化生产药物的目的。在川黄柏细胞悬浮培养,首先将在固体培养基上获得的生长旺盛的、排列较疏松的川黄柏愈伤组织按一定数量转入MS液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养3天后，依据细胞的生长状况可确立获得的第一代川黄柏细胞悬浮液。并对该细胞悬浮液进行细胞活力的测定和细胞密度计数。川黄柏细胞悬浮培养体系建立的技术参数确立 ：①用于细胞悬浮的基本培养基MS、B5、SH、White等的筛选； ②培养基中激素配比、接种量、光照条件、碳源、pH值等因素对培养细胞的生长速度和次生代谢物含量的影响研究； ③悬浮培养液中细胞重量的测定和生长曲线的绘制。 ④川黄柏中小檗碱的的提取、分离、纯化和用高效液相色谱法（HPLC）测定含量 （5）专项五：川黄柏多倍体诱导研究 多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。多倍体特别是异源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化,同时多倍体的基因剂量倍增,从而使植物的新陈代谢旺盛,其体内的某些生化成分的含量也相应提高。另外,植物多倍体使植株基因活性及酶的差异性增强,从而加强了植株的生态适应力和对逆境的抗性,使其在生活力、对环境适应性,抗旱、抗寒及抗病虫害等表现出明显的优势。川黄柏植物是重要的药用植物，选育优良的川黄柏植物品种是提高其药材质量和产量的有效途径。本项目首次采用秋水仙素对川黄柏茎段愈伤组织、种子和腋芽进行多倍体诱变处理。经植物形态学和染色体数检测, 诱导后的材料具有明显的多倍体特征.因此采用秋水仙素对川黄柏不同部位进行多倍体诱导，是一种行之有效的生物技术方法。 （6）专项六：川黄柏染色体制作和核型分析研究 染色体核型分析是细胞遗传学、染色体工程、现代分类学和进化理论的重要手段，也是一种简便的方法。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物种质资源遗传性研究的重要内容。由于染色体长臂和短臂不一，就表现出着丝点位置不同。此外，在核型分析中，次缢痕或核仁组成区（NOR）和随体（SAT）的数目、分布和大小的差异，常常成为区分某些近缘种或属的主要特征，因此，它们识别与判断极为重要。本文首次利用川黄柏新生的愈伤组织为实验材料进行染色体制片，获得了川黄柏染色体数目和核型分析资料，并为川黄柏的细胞遗传学研究提供了理论依据. （7）专项七：川黄柏毛状根的诱导及活性成分的产生 毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术,它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上,诱导植物细胞产生毛状根.如今,植物毛状根培养被认为是获得有用次生代谢产物的重要途径.如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为人们关注的焦点.毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性,毛状根可以在不含激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物.因此,毛状根被认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料.近年来培养珍贵药用植物毛状根来获取次生代谢产物成为国内外研究的热点.本实验首次利用发根农杆菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000诱导川黄柏不同外植体产生毛状根。经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中，HPLC测定结果显示，川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱，并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。 （8）专项八：川黄柏高效遗传转化系统的建立和植株再生的研究 在研究川黄柏组培苗快繁方法和川黄柏毛状根的诱导的基础上,首次利用发根农杆菌R1601高频转化川黄柏带子叶下胚轴,并将获得的毛状根置于含不同生长调节物质配比的培养基上诱导产生转基因再生植株。建立了一套发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。 （9）专项九：川黄柏不同部位中盐酸小檗碱的研究 川黄柏中主要含有小檗碱、黄柏碱和木兰碱（magnoflorine）等,但主要以小檗碱为主。本实验采用HPLC测定了由以上实验所获得的愈伤组织、悬浮细胞、多倍体植株、毛状根和川黄柏植物的树皮中盐酸小檗碱的含量。结果显示采用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导、染色体核型分析和转基因等一系列现代生物工程技术,的确可以培育含有效药用成分含量高和质量稳定等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种。 （10）专项十:川黄柏离体培养和药用成分的抑菌试验研究 尽管川黄柏中主要有效抗菌成分是盐酸小檗碱，但在川黄柏植物体中还含有巴马亭、药根碱、黄柏碱和黄柏酮等其他有效抗菌成分。本实验根据中药是多成分用药原则，综合研究了由以上实验所获得的愈伤组织、悬浮细胞、多倍体植株、毛状根和川黄柏植物的树皮中多种抗菌成分的联合抗菌作用，从而真实客观地反映愈伤组织、悬浮细胞、多倍体植株、毛状根和川黄柏植物的树皮中药物的抑菌效力。结果显示采用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导、染色体核型分析和转基因等一系列现代生物工程技术,的确可以培育含有效药用成分含量高、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种。 3．发现、发明及创新点： 1、报道川黄柏离体器官诱导愈伤组织的研究结果，为今后通过组织培养直接从愈伤组织中提取小蘖碱奠定基础。 2、首次采用正交试验法获得了川黄柏叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次建立了一套以川黄柏成熟叶片为外植体的植株再生的快速繁殖技术。研究出最佳诱导愈伤组织培养基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，诱导率均为100%；不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培养基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 4、以川黄柏的叶片、叶柄、茎段为外植体诱导出松散型白色愈伤组织,诱导愈伤的培养基为MS+6-BA2.0mg/L+2.4-D2.0mg/L。将培养的愈伤组织进行继代和悬浮培养,经两代悬浮培养后，对第三代悬浮培养情况进行细胞生长曲线绘制，实验结果表明为S型细胞生长曲线。同时将悬浮获得的细胞产物经HPLC测定确定其含有盐酸小檗碱，故可确定产物中含有盐酸小檗碱。 5、首次采用秋水仙素对川黄柏茎段愈伤组织、种子和腋芽进行多倍体诱导，成功获得了具有明显多倍体特征的川黄柏多倍体植株。 6、首次对川黄柏植物体细胞进行染色体核型分析研究。获得了川黄柏核型公式为K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部着丝点染色体（m）为34对，并有一对带有随体；近中部着丝点染色体（sm）为3对；端部着丝点染色体（T）为3对；川黄柏体细胞染色体数为2n=80。 7、首次利用发根农杆菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000对木本植物川黄柏进行了遗传转化研究，经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中，该实验取得了成功。并用HPLC测定其盐酸小檗碱含量，结果显示川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱，并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。 8、建立了一套发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。利用发根农杆菌R1601高频转化川黄柏带子叶下胚轴并获得毛状根，通过将川黄柏毛状根转入芽分化培养基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中对不定芽进行诱导，首次获得了川黄柏转基因植物。 9、在川黄柏遗传转化的脱菌实验环节，首次提出采用配制的500 mg•L-1头孢噻肟钠脱菌水清洗产生了菌斑的转化外植体，使转化外植体成活率大大的提高，保证了遗传转化实验的成功。 10、采用HPLC测定了川黄柏植物的树皮、一年生幼叶和三年生老叶中盐酸小檗碱的含量。结果表明：川黄柏树皮、幼叶和老叶中都含有盐酸小檗碱，其中树皮含量为5.6%、一年生幼叶为0.33%、三年生以上老叶为0.52%. 11、本项目根据中药多成分用药原则，首次综合研究了川黄柏植物体中多种抗菌成分的联合抗菌作用，比较了川黄柏不同活性成分的抑菌效力大小，从而真实客观地反映川黄柏药物的抑菌效力，为进一步开发川黄柏药物资源奠定了理论基础。 4．与当前国内外同类研究、同类技术的综合比较： （1）整体技术达到国内领先水平 该项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,培育出含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种，从而为解决川黄柏市场资源短缺的问题，同时保护川黄柏的野生资源。通过将这一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，其最终目的可以将这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物。以解决目前我国传统的中药材面临以下诸多问题。采用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导、染色体核型分析和转基因等一系列生物工程技术发展中药材生产。是积极响应四川省正在实施“7+3”产业。所以用生物工程技术进行中药产业开发是非常有意义的。本项目10个专项内容均达到国内领先或先进水平，整体技术国内领先。 （2）创新性强 国内外目前对川黄柏的研究报道了川黄柏离体器官诱导愈伤组织，并且测定了盐酸小 檗碱的含量。但是对于川黄柏的深层次研究尚未见到报道。本项目的创新性体现在以下8方 面： 1、首次采用正交试验法获得了川黄柏叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 2、首次建立了一套以川黄柏成熟叶片为外植体的植株再生的快速繁殖技术。研究出最佳诱导愈伤组织培养基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，诱导率均为100%；不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培养基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次采用秋水仙素对川黄柏茎段愈伤组织、种子和腋芽进行多倍体诱导，成功获得了具有 明显多倍体特征的川黄柏多倍体植株。 4、首次对川黄柏植物体细胞进行染色体核型分析研究。获得了川黄柏核型公式为K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部着丝点染色体（m）为34对，并有一对带有随体；近中部着丝点染色体（sm）为3对；端部着丝点染色体（T）为3对；川黄柏体细胞染色体数为2n=80。 5、首次利用发根农杆菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000对木本植物川黄柏进行了遗传转化研究，经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中，该实验取得了成功。并用HPLC测定其盐酸小檗碱含量，结果显示川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱，并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。 6、建立了一套发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。利用发根农杆菌R1601高频转化川黄柏带子叶下胚轴并获得毛状根，通过将川黄柏毛状根转入芽分化培养基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中对不定芽进行诱导，首次获得了川黄柏转基因植物。 7、在川黄柏遗传转化的脱菌实验环节，首次提出采用配制的500 mg•L-1头孢噻肟钠脱菌水清洗产生了菌斑的转化外植体，使转化外植体成活率大大的提高，保证了遗传转化实验的成功。 8、本项目根据中药多成分用药原则，首次综合研究了川黄柏植物体中多种抗菌成分的联合抗菌作用，比较了川黄柏不同活性成分的抑菌效力大小，从而真实客观地反映川黄柏药物的抑菌效力，为进一步开发川黄柏药物资源奠定了理论基础。 （3）产业化程度高，经济、社会和生态效益显著 通过组织培养技术快速繁殖可脱除无性繁殖川黄柏植物体内的病毒，获得并保存无病毒川黄柏种苗。脱毒使川黄柏品种复壮，提高产量，改进品质。解决川黄柏植株雌雄异株而留种困难、采用有性繁殖其种子变异率大而难以保证品种特性、利用扦插繁殖但插条难生根和繁殖速度慢等问题。通过组织培养技术可以加快川黄柏植株繁殖系数，快速繁殖川黄柏种苗，经济、安全地保存川黄柏植物种质资源。用组织培养技术保存植物种质资源不受气候、土壤、病虫害影响，节省土地和人力资源。 项目中的细胞悬浮培养技术，对川黄柏离体器官进行诱导愈伤组织，通过激素的调节，诱导出生长旺盛的、排列较疏松的适合于细胞悬浮培养的愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养，建立川黄柏的细胞悬浮培养体系。药用植物细胞悬浮培养技术是当今药用植物实现工业化生产的必经之路。通过不断改善植物细胞体外培悬浮培养条件，可大大地提高生物细胞中次生代谢的含量，并且还可以通过向培养基中添加药物合成的前体物质，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有效成分的含量；另外，对悬浮培养的细胞进行特定的生物遗传转化反应，也将获得新的药物成分，从而可很好地实现了天然植物大规模工业化生产药物的目的。 本项目中的多倍体诱导技术，主要是采用化学试剂秋水仙素对川黄柏的外植体进行处理，从而诱导多倍体的川黄柏。多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。多倍体特别是异源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化,同时多倍体的基因剂量倍增,从而使植物的新陈代谢旺盛,其体内的某些生化成分的含量也相应提高。另外,植物多倍体使植株基因活性及酶的差异性增强,从而加强了植株的生态适应力和对逆境的抗性,使其在生活力、对环境适应性,抗旱、抗寒及抗病虫害等表现出明显的优势。 本项目中的药用植物植物转基因技术，是通过采用发根农杆菌ATCC15834、A4、R1000、R1600、R1601诱导川黄柏的外植体产生毛状根,再对毛状根进行增殖培养. 药用植物转基因技术是通过将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上,诱导植物细胞产生毛状根.对诱导产生的毛状根进行培养与增殖的技术.毛状根培养与增值技术是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术.如今,植物毛状根培养被认为是获得有用次生代谢产物的重要途径.如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为人们关注的焦点.毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性,毛状根可以在不含激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物.因此,毛状根被认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料.近年来培养珍贵药用植物毛状根来获取次生代谢产物成为国内外研究的热点.利用毛状根培养来生产次生代谢产物,其生长迅速,分支多,次生代谢产物含量高,不需要外源激素,而且比细胞培养容易放大.研究发现,在毛状根培养过程中,改变培养条件或利用相关生物技术手段能够提高毛状根中次生代谢产物的积累.改变培养条件主要分为改变化学条件和物理条件两大类.化学条件的改变一般都是对培养基中的培养成分进行改变,比如添加激素,或者对培养基中的营养成分种类、配比进行调节等等;物理条件的改变一般是改变光的照射时间或者光的颜色以及培养温度等条件.生物反应器就是将化学条件和物理条件融为一体而设计出来的次生代谢产物高产的一种装置,针对不同的植物的毛状根,生物反应器的大小、形状以及设计原理等对其次生代谢产物的产出都有很大的影响.此外,针对不同植物毛状根,通过添加诱导子、饲喂前体化合物以及应用反义技术等生物技术手段也可以大大提高次生代谢产物的产量。 6．应用情况： 从2002年起，通过查阅相关文献，走访调查等方式，全面调查了川黄柏相关情况。国内市场每年对黄柏的需求量逐年增加。据对全国17家大型药材市场及中药材原料行业每年所需用的黄柏总量估算，进入21世纪后，需求量锐增，2000～2001年为1000～1200吨，2006年增加至3000～3200吨左右，2008年上升至3500～3800吨，至2009年更有望抬升到5000吨。但是，经过多年砍伐剥皮，资源已经不多。 80年代,计划经济向商品经济转换,管理失控,盲目乱砍乱伐,野生资源破坏极为严重。其中大部分用于提取小蘖碱,许多幼树亦遭厄运,资源受到毁灭性破坏.目前川黄柏主要来源于人工大面积栽种黄皮树.黄皮树雌雄异株,留种困难,且采用有性繁殖,其种子变异率大,难以保证品种特性,而利用扦插繁殖，插条难生根，繁殖速度慢，并且川黄柏药用树皮时,不包括细枝皮和根皮,而是使用较厚的主干及枝干皮。为此,一般应采剥生长15年以上的树皮。这种单纯从大自然中提取原材料的做法不仅已远远不能满足市场的需求，而且还破外了野生资源，使野生资源锐减。同时，在种植过程中，川黄柏中存在农药残留、重金属含量过高、质量不稳定等问题严重影响了药材质量，阻碍了中药川黄柏现代化的研究。 项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,培育出了含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种，为解决川黄柏市场资源短缺奠定了基础。同时保护川黄柏的野生资源。通过将这一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，已经成功地应用到了一些其他的药用植物上，譬如，杜仲，菘蓝，川贝母，喜树等，培育出了含有多种优良性状的药用植物新品种。 本项目通过组织培养技术快速繁殖得到大量的无病毒川黄柏种苗，在很短的时间内为成都市都江堰的农民提供了很多的无病毒种苗，具有重大的经济价值。本项目通过细胞悬浮培养和转基因技术分别获得了大量川黄柏细胞悬浮液和生长迅速的毛状根，将大量川黄柏细胞悬浮液和生长迅速的毛状根培养于发酵罐，结果效果显著，得到了大量的培养物。本实验通过多倍体诱导技术，获得了大量的多倍体川黄柏植株，通过炼苗后，将大量的川黄柏植株移栽于试验田中，目前长势良好。 作为川黄柏药用树皮时，一般是剥取生长15年以上的树皮，并且经砍伐后的川黄柏植株又不能再生，而采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术培育出的川黄柏新品种，生长周期短，大约在2个月之内可以完成一个周期。因此在15年之内，可以完成90个生长周期。经过测定川黄柏树皮中小檗碱含量为5.6%，而组培苗和毛状根中小檗碱的含量分别1.231%、1.346%，因此，在完成90个生长周期内，其产量是大幅度地上升。并且采用生物工程技术，培养条件可以人为控制和调节，四季均可生产，不受地区、恶劣气候、季节、黑夜及有害生物的影响，并且生长条件均一，占地面积少，在有限的时间和空间里便于工厂化生产，可对细胞生长自动控制和代谢过程合理调节，个体差异小，生产周期短，设备简单，能节省人力、物力等。 成果转化、推广或产业化方面还需要帮助解决的问题 通过将一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，其最终目的是将这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物，但由于资金上的短缺，并不能够在短期内将这一系列技术更好地普及到我国其他药用植物上。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,旨在培育含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川黄柏新品种，解决川黄柏市场资源短缺的问题，保护野生资源。通过川黄柏示范研究，最终目的是将这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物，以解决目前制约我国传统中药材实现现代化面临的诸多问题。
科学性、先进性及独特之处
- （1）整体技术达到国内领先水平：该项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,培育出含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种。 （2）创新性强：本项目的创新性体现在8个方面。 （3）产业化程度高，经济、社会和生态效益显著。
应用价值和现实意义
- 本项目通过组织培养的研究，培育出快速繁殖的川黄柏组培苗；通过细胞悬浮培养的研究，筛选出生长速度快的细胞株，提供大量次生代谢产物含量高的培养物，为工业化生产奠定基础。多倍体诱导研究，培育出器官表现出巨型性、次生代谢产物含量增加、生态适应性和对逆境的抗耐性强的新品种。转基因的研究，培养出有效药用成分含量高、在无激素的培养基上疯狂生长的毛状根，为可持续性次生代谢物生产提供一条可靠和有效途径。
学术论文摘要
- 本项目采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列现代生物工程技术,旨在培育含有效药用成分含量高、生长速度快、质量稳定、绿色无污染、品质优良、可排除病菌和虫害的侵染等多种优良性状的川产道地药材川黄柏新品种，从而为解决川黄柏市场资源短缺的问题，同时保护川黄柏的野生资源。通过将这一系列现代生物工程技术应用到中药材川黄柏示范研究上，其最终目的可以将这一系列现代生物工程技术普及到我国的其它药用植物，以解决目前我国传统的中药材面临制约了中药材的中药现代化的研究诸多问题。中药现代化不仅是一场传统中药的新技术革命，更是一次现代中药的新文化运动。积极采用药用植物组织培养、细胞悬浮培养、多倍体诱导和转基因等一系列生物工程技术发展中药材生产。将生物工程技术进行中药产业开发是非常有意义的。本项目通过川黄柏的示范研究，将这一系列现代生物工程技术普及到我国其他药用植物之上，最终目标是实现我国中药现代化，从传统中医药资源中筛选、深度开发达到现代国际质量标准的天然药物,这是我国医药产业自主创新的优选开发途径,也是中医药走向世界的必经之路。
获奖情况
- （1）该作品获得第十届“挑战杯”四川省大学生课外学术科技作品竞赛一等奖。 （2）该项目共发表系列研究论文9篇；其中《川黄柏高效遗传转化系统的建立和植株再生的研究》、《川黄柏多倍体诱导研究》和《川黄柏染色体制作和核型分析研究》论文被国际著名检索机构CA收录。目前已完成发明专利2项。
鉴定结果
- 首次建立以川黄柏叶片的快速繁殖技术；首次采用秋水仙素对川黄柏进行多倍体诱导；首次进行染色体核型分析研究；首次利用发根农杆菌对川黄柏进行了遗传转化研究；首次研究了川黄柏中多种抗菌成分的联合抗菌作用。
参考文献
- 1、愈伤组织诱导 2、成熟叶片植株再生 3、正交设计法在组织培养中的应用 4、细胞悬浮培养 5、多倍体诱导研究 6、染色体制作和核型分析 7、毛状根的诱导及活性成分的产生 8、高效遗传转化系统的建立和植株再生 9、离体培养和药用成分的抑菌试验 10、转基因技术
同类课题研究水平概述
- 创新性强 本项目的创新性体现在以下8方面： 1、首次采用正交试验法获得了川黄柏叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.0mg/L+IAA0.3mg/L。 2、首次建立了一套以川黄柏成熟叶片为外植体的植株再生的快速繁殖技术。研究出最佳诱导愈伤组织培养基MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D4.0mg/L、MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D1.0mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，诱导率均为100%；不定芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；生根培养基MS+NAA0.3mg/L+IAA0.3mg/L。 3、首次采用秋水仙素对川黄柏茎段愈伤组织、种子和腋芽进行多倍体诱导，成功获得了具有 明显多倍体特征的川黄柏多倍体植株。 4、首次对川黄柏植物体细胞进行染色体核型分析研究。获得了川黄柏核型公式为K(2n)=80=68m(2SAT)+6sm+6T。其中中部着丝点染色体（m）为34对，并有一对带有随体；近中部着丝点染色体（sm）为3对；端部着丝点染色体（T）为3对；川黄柏体细胞染色体数为2n=80。 5、首次利用发根农杆菌ATCC15834、A4、 R1600和R1000对木本植物川黄柏进行了遗传转化研究，经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中，该实验取得了成功。并用HPLC测定其盐酸小檗碱含量，结果显示川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱，并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。 6、建立了一套发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。利用发根农杆菌R1601高频转化川黄柏带子叶下胚轴并获得毛状根，通过将川黄柏毛状根转入芽分化培养基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L)中对不定芽进行诱导，首次获得了川黄柏转基因植物。 7、在川黄柏遗传转化的脱菌实验环节，首次提出采用配制的500 mg•L-1头孢噻肟钠脱菌水清洗产生了菌斑的转化外植体，使转化外植体成活率大大的提高，保证了遗传转化实验的成功。 8、本项目根据中药多成分用药原则，首次综合研究了川黄柏植物体中多种抗菌成分的联合抗菌作用，比较了川黄柏不同活性成分的抑菌效力大小，从而真实客观地反映川黄柏药物的抑菌效力，为进一步开发川黄柏药物资源奠定了理论基础。
