基本信息
- 项目名称：
- 产植酸酶及中性内切纤维素酶毕赤酵母基因工程菌的构建及表达研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究实现植酸酶和中性内切纤维素酶基因在毕赤酵母中共表达，在节约资源，降低生产成本，提高饲料利用率，减少环境污染等方面具有重要的现实意义，目前国内外未见同类报道。
- 详细介绍：
- 饲料中的磷一般以植酸（肌醇六磷酸）的形式存在，是一种抗营养因子，其自然分解率很低，猪和禽等单胃动物体内又很少有能分解植酸磷的酶存在，一般很难被动物直接利用，常通过添加骨粉或磷酸盐来补充矿物质，大量的植酸磷不能被利用而从粪便中排除，环境污染严重。因此植酸酶的添加能有效提高饲料中磷的利用率，促进动物生长，减少环境污染。 由于禽畜一般以植物性饲料为主，植物当中含有大量的纤维素和半纤维素，除少数单胃动物能吸收一部分，绝大多数被直接排出体外，造成饲料利用率大大降低，且污染环境。另一方面，我国如秸秆等丰富廉价的纤维素资源浪费严重，还易造成环境污染。纤维素酶的利用能大大提高饲料纤维素利用率，促进动物营养物质的吸收。 将植酸酶和中性内切纤维素酶在毕赤酵母中共表达，使之同时具有两种酶活性，将大大降低生产成本，提高经济效益，减少环境污染。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 利用基因工程手段使植酸酶和纤维素酶在酵母中共表达将可以大大降低生产成本，提高经济效益，也为饲料酶制剂的产业化奠定基础。 本研究是在生物化学实验室已构建植酸酶phyAm基因重组酵母株GS115-phyAm的基础上，运用基因工程技术，将成功构建并线性化处理的重组载体pPICZα-End转入GS115-phyAm中。经过诱导培养、酶活力测定最终筛选获得共表达且活性较高的转化子。
科学性、先进性及独特之处
- 目前纤维素酶基因绝大多数在大肠杆菌中表达，酶活较低，毕赤酵母为真菌表达系统，具有表达量高、易于工业发酵等优点。 将植酸酶和中性内切纤维素酶的基因在酵母系统中共表达，使其同时具有两种酶的活性，这在节约资源，降低生产成本，提高饲料利用率等方面具有重要的现实意义，目前国内外未见同类报道。
应用价值和现实意义
- 饲料中的磷一般以植酸的形式存在，为抗营养因子，其自然分解率很低，植酸酶能有效分解植酸，促进家禽对磷的吸收。禽畜一般以植物性饲料为主，植物当中含有大量的纤维素和半纤维素，除少数单胃动物能吸收一部分，绝大多数被直接排出体外，纤维素酶能有效分解纤维素。本研究实现中性内切纤维素酶和植酸酶的共表达，为降低饲用酶的生产成本，提高饲料利用率，减少环境污染提供了实验依据。
学术论文摘要
- 植酸酶和纤维素酶在饲料中的良好作用已得到广泛证实。本研究在生物化学实验室构建的含植酸酶phyAm基因并经过密码子优化的重组酵母株GS115-phyAm的基础上，根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中性内切纤维素酶基因序列设计引物，采用PCR扩增获得去除信号肽后约1.4 kb的中性内切纤维素酶基因片段，以此片段构建pPICZα-End载体，经SacⅠ酶切线性化处理，通过电击转化法将线性化的pPICZα-End载体导入GS115-phyAm中。经过诱导培养、酶活力测定，筛选获得共表达转化子GS115-phyAm-E-4、GS115-phyAm-E-8，其植酸酶活力分别为8667U/mL、7280U/mL，分别为密码子优化重组酵母株GS115-phyAm的18.2%和15.3%；中性内切纤维素酶活分别达到256.4U、298.6U，分别为原始菌株的4.02倍和4.68倍。
获奖情况
- 荣获本届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛校内选拔一等奖； 荣获本届“挑战杯” 大学生课外学术科技作品竞赛省级选拔一等奖
鉴定结果
参考文献
- 1.陈惠，赵海霞，王红宁等. 植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量，中国生物化学与分子生物学报,2005,21(2):171-175 2.张莉，赵耘，王郡美.植酸酶在饲料工业中的应用及其研究进展.畜牧兽医科技信息，2006，8：7-9 3.李明华，张大伟等. 饲料纤维素的研究与应用进展.饲料与畜牧，2006，4：28-32 4.沈雪亮，夏黎明，刘景晶．浙江大学学报．Recombination and expression of cellulase E5 gene (J). 2001, 35(6): 640-646 5.陈惠，胥兵等.内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌汇总的表达及其酶学性质研究.遗传，2008，30（5）：649-654
同类课题研究水平概述
- 植酸酶和纤维素酶在饲料工业中的重要作用已得到广泛证实。 目前对植酸酶phyA基因研究的较多，如霍丹群，范守城等（2007），将phyA基因克隆并在大肠杆菌中高效表达，使其活性达到1193U；黄添孙和骆旭添（2008）将植酸酶phyA基因转入巴斯德毕赤酵母中，优化表达条件后，植酸酶酶活达到106U/mL;唐光桂等（2008）利用透明颤菌血红蛋白在低氧条件下提高毕赤酵母中植酸酶的表达，使其酶活达到249U/mL；陈惠等（2005）已构建植酸酶phyAm基因重组酵母株GS115-phyAm，活性达47600U/mL。 目前已克隆出基因的纤维素酶还十分有限，绝大多数已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到表达，但表达量比较低。沈雪亮等(2001)已经将纤维素酶E5基因在E.coli中进行了克隆与表达，并且基因重组后的大肠杆菌能高效表达E5基因并将产物分泌出胞外，培养液中可检测到的CMCase活力达31.6 U。丁少军等(2006)将中性内切纤维素酶在毕赤酵母中表达，并筛选出高拷贝菌株，实现了高水平表达。胥兵等(2008)将内切纤维素酶基因在巨大芽胞杆菌中进行了表达，可检测到的酶活为889 U。利用巨大芽胞杆菌表达发现内切纤维素酶对宿主菌具有毒性，严重影响工程菌的生长，从而影响表达产量。 目前基因共表达在生物医学工程中运用较多，如周春丽等（2008）构建了pCDR1Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体；曹素芳和黄青云（2008）对共表达C48-1H基因和鸡IL-18基因重组DNA疫苗的免疫保护性做了研究；马彦彬，戴五星等（2008）构建了人结核杆菌休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒并在体外表达。李海燕，毛爱军等（2004）将黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中共同表达，该研究是通过构建黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母Yip型载体Pnew4,与G418抗性质粒共转化，从而将糖化酶和木聚糖酶基因表达原件整合到多倍体酒精生产用酵母cerevisiae2.346染色体上，获得整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11。将植酸酶和中性内切纤维素酶在毕赤酵母中共表达目前未见报道。
