基本信息
- 项目名称：
- 快速鉴别诊断PRRSV高热变异株和北美株的RT-PCR检测试剂盒的研究与应用
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究旨在建立联合检测猪繁殖与呼吸综合征病毒高热变异株和北美株的RT-PCR检测方法，将各种反应液组装为快速检测试剂盒，并对特异性、敏感性、重复性、保存条件等指标进行测定，以期实现该试剂盒的标准化，结果显示该试剂盒敏感性高、特异性强，较为稳定，同时初步运用于临床病料的检测，并与现有高致病性蓝耳病的检测试剂盒进行平行比较。
- 详细介绍：
- 2006年6月，江西、广东、湖南、湖北等多个省份先后发生了猪的“无名高热病”流行，疫区养猪业为此遭受了巨大经济损失。有研究结果显示PRRSV的基因缺失株是疫病流行的主要病原之一，核酸序列分析表明该毒株与北美株同源性仅为90%，区分变异毒株与普通毒株感染成为该病预防控制的技术关键。本研究目的在于： 在建立快速检测高热变异株和北美株的RT-PCR方法基础上，研制相应试剂盒，以实现生产上对“高热病”的快速检测，从而为更好地预防和控制该病的发生提供技术保障。 根据Genbank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计出PRRSV高热变异株和北美经典株的上、下游引物，建立单一RT-PCR检测方法，分别扩增出186bp和470bp的特异性片段，在此基础上建立PRRSV高热变异株和北美经典株双重RT-PCR检测方法并进行条件优化。在建立了两个毒株的双重RT-PCR检测方法的基础上，将这两个毒株的特异性引物与RT-PCR反应液混合组装为快速检测的试剂盒。本试验通过对试剂盒的敏感性、特异性、重复性、稳定性、保存期、保存条件等技术指标的测定，以及对临床病料的检测试验，结果显示该试剂盒敏感性高、特异性强，较为稳定，能快速检测出PRRSV，为临床确诊提供依据。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 2006年，我国多个省份先后发生了猪的“无名高热病”流行，疫区养猪业为此遭受了巨大经济损失。有研究表明其主要病原为PRRSV的基因缺失株，区分变异毒株与普通毒株感染成为该病预防控制的技术关键。本研究目的在于： 在建立快速检测高热变异株和北美株的RT-PCR方法基础上，研制相应试剂盒，以实现生产上对“高热病”的快速检测，从而为更好地预防和控制该病的发生提供技术保障。
科学性、先进性及独特之处
- 1、所建双重RT-PCR检测技术不仅能快速检测 PRRSV，同时能据所扩增出的特异性片段大小差异区别高热变异株和普通毒株； 2、研制试剂盒使用方便、特异性、灵敏度、可重复性和稳定性好；
应用价值和现实意义
- 2006年，我国多个省份先后发生了猪的“无名高热病”流行，疫区养猪业为此遭受了巨大经济损失。有研究表明其主要病原为PRRSV的基因缺失株，区分变异毒株与普通毒株感染成为该病预防控制的技术关键。在建立快速检测高热变异株和北美株的RT-PCR方法基础上，研制相应试剂盒，以实现生产上对“高热病”的快速检测，从而为更好地预防和控制该病的发生提供技术保障。
学术论文摘要
- 摘要: 根据Genbank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计出PRRSV高热变异株和北美经典株的上、下游引物，建立单一RT-PCR检测方法，分别扩增出186bp和470bp的特异性片段，在此基础上建立PRRSV高热变异株和北美经典株双重RT-PCR检测方法并进行条件优化。在建立了两个毒株的双重RT-PCR检测方法的基础上，将这两个毒株的特异性引物与RT-PCR反应液混合组装为快速检测的试剂盒。本试验通过对试剂盒的敏感性、特异性、重复性、稳定性、保存期、保存条件等技术指标的测定，以及对临床病料的检测试验，结果显示该试剂盒敏感性高、特异性强，较为稳定，能快速检测出PRRSV，为临床确诊提供依据。 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征、RT-PCR、检测试剂盒
获奖情况
- 荣获第六届“挑战杯”校级大学生课外学术科技作品竞赛一等奖； 荣获第十届“挑战杯”省大学生课外学术科技作品竞赛一等奖；
鉴定结果
参考文献
- RT-PCR技术。最近国外和国内均建立了RT-PCR检测方法。国外应用PCR诊断PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列，设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法，并获得较高的敏感性和特异性。一些学者在ORF1b的基础上扩增引物，建立了RT-PCR方法来检测PRRSV的RNA核苷酸，并将其与病毒分离和血清学方法进行比较，证明RT-PCR方法比其它两种方法更敏感更有效。我国娄高明等[12]根据PRRSV的ORF7序列，设计一套引物建立了RT-PCR方法，试验结果证明其效果较好，且可从基因水平上区分PRRSV美洲型和欧洲型，而且对国内疑似为PRRSV送检样品进行检测，确定其为美洲型。 娄高明,杜伟贤,谢明泉,等.猪繁殖与呼吸综合征RT-PCR诊断方法的建立[J].中国兽医学报,2000, (3):141-144.
同类课题研究水平概述
- RT-PCR技术。最近国外和国内均建立了RT-PCR检测方法。国外应用PCR诊断PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列，设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。可以直接从PAM分离培养物、临床样品(肺泡巨噬细胞、血清和血浆，肺脏组织以及精液等)中扩增出预期的片断，并获得较高的敏感性和特异性。一些学者在ORF1b的基础上扩增引物，建立了RT-PCR方法来检测PRRSV的RNA核苷酸，并将其与病毒分离和血清学方法进行比较，证明RT-PCR方法比其它两种方法更敏感更有效，在感染后24h就可检测出病毒RNA核苷酸，而在检测血清样品中，当可能存在最低浓度的循环病毒时，在感染初期及感染晚期(28d)经RT-PCR检测为阳性，而用病毒分离法检测时，其中一些样品却为阴性。同时他们还建立了针刺耳静脉，用滤纸片收集全血取样的方法，这样可以减少污染机会，且可进行大量猪群的检测。我国娄高明等[12]根据PRRSV的ORF7序列，设计一套引物建立了RT-PCR方法，试验结果证明其效果较好，且可从基因水平上区分PRRSV美洲型和欧洲型，而且对国内疑似为PRRSV送检样品进行检测，确定其为美洲型。因此PRRSV山东分离株ORF7基因的原核表达与RT-PCR快速检测方法无疑是一种快速、准确、灵敏的诊断方法。 孔繁德，王英，陈琼等[14]根据猪瘟病毒（CSFV）和猪蓝耳病（PRRSV）的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物，并建立了多重RT—PCR方法，分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定，结果表明能同时扩增得到2条与试验设计相符的167bp（CSFV）和320bp（PRRSV）特异性条带，同时具有较好的特异性；敏感性检测结果表明，临床阳性的样品提取的核酸稀释1000倍后仍能检测出CSFV和PRRSV。本方法的建立对于这2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。
