基本信息
- 项目名称：
- 上转化纳米颗粒发光技术在肿瘤治疗中的应用研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 上转化荧光成像技术（upconverting phosphor technology，UPT）是基于上转换发光材料而发展起来的一种新型标记技术。上转化颗粒（unconversion particle，UCP）是由数种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的颗粒，这种材料可在红外光区被激发，却发射波长远短于激发光的可见光。根据文献检索，UPT在生物领域运用都只是在细胞或动物上的简单尝试，以证明其可行性及高效优越性。 本课题组成功制作的粒径小于10nm的UCP纳米颗粒（UCPnano），经物理学检测，发光性能良好。本研究拟将UCPnano表面有机化处理，检测其特性，为其在生物领域的广泛运用奠定基础。进一步，用抗血管内皮生长因子抗体（anti-VEGF）标记有机化UCPnano，实验性将UCPnano运用到肿瘤手术，利用其靶向标定肿瘤组织，显示肿瘤侵犯边界和淋巴结转移，以期指导手术，并为肿瘤综合治疗和预后提供参考，同时为该技术广泛运用于肿瘤的诊断、治疗提供新的思路。
- 详细介绍：
- 一、上转化颗粒（upconversion particle，UCP） 上转换荧光成像技术（up-converting phosphor technology，UPT）是基于上转换发光材料而发展起来的一种新型标记技术。UCP是由数种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的颗粒。由于其独特的结构，这种材料可在红外光区（波长>780 nm）被激发，却发射波长远短于激发光的可见光（波长为300~750 nm）。 UPT的特点是：抵抗光漂白、无毒、生物相容性好、光化学稳定性强、近红外光激发对活体组织没有光损伤、自发荧光极低几乎无背景噪音、宽的激发光谱、窄的发射光谱、光亮度强、探测灵敏度极高、在生物组织中光穿透深度高，对检测设备要求低易于普及推广。 根据文献检索，UPT在生物领域运用的文章最早始于2001年，截止2008年底，关于UPT在生物学的运用研究报告仅有6篇，都只是在细胞或动物上的简单尝试，以证明其在生物运用上的可行性及其上转换颗粒发射光的高效优越性，这些实验发现都证明了上转换荧光成像技术在生物运用上具有巨大的潜能。 本课题组成功制作的粒径小于10nm的UCP纳米颗粒（UCPnano）。经物理学检测，发光性能良好，在980nm波下激发下，发射波长从300~750nm的任意窄波长的UCP颗粒均已成功制备。目前尚未见文献有类似报道，该技术属国际领先。 二、本课题的设计思想 由于UCPnano在980nm激发波长下可以发出强可见光，因此，如果能将UCPnano有机化包被并加挂特异抗体，则有可能为肿瘤的标记和定位提供极大便利，从而应用于辅助临床肿瘤的手术治疗。 （1）UCPnano的有机化包被 本研究首先要解决UCPnano的有机亲水物包被，拟采用的策略是叠层法（layer-by-layer，LbL）将NH2基团挂到UCPnano上。该方法已经成功应用于QD和磁颗粒的有机化包被，属成熟技术。 （2）有机化和靶向包被UCPnano标记肿瘤细胞和组织 要将有机物包被后的UCPnano运输至肿瘤处，需要靶向制剂。本研究选择单克隆抗体（McAb）作为将UCPnano导向肿瘤的介质，实现有机化UCPnano的靶向包被。McAb是利用B细胞杂交瘤技术获得的特异性针对某一种抗原决定簇的抗体，具有高度均一性、专一性及稳定性的特性。 肿瘤血管的形成与肿瘤的生长、浸润、转移及复发密切相关，是影响肿瘤患者预后的重要因素，无血管生成的肿瘤组织不能够生长成为实体的肿瘤，这是因为新生血管是提供病理组织养分保证其生长增殖的基础。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth-factor，VEGF）被认为是最重要的血管新生相关因子，VEGF通过刺激内皮细胞增殖，增加血管尤其是微小血管的通透性来促进血管形成和新生血管网的建立。 研究表明许多肿瘤存在新生淋巴管，血管内皮细胞生长因子C（VEGF-C）、血管内皮细胞生长因子D（VEGF-D）及其受体VEGFR-3是重要的促淋巴管生成因子，与肿瘤淋巴管播散转移和预后密切相关。 由于VEGF在多数实体肿瘤新生血管内皮细胞中高表达，把抗VEGF单克隆抗体（anti-VEGF）作为靶向引导UCPnano进行特异性肿瘤标记的制剂将具有广泛的运用价值，同时VEGF家族成员VEGF-C、VEGF-D及其受体VEGF-3与肿瘤的淋巴道转移密切相关，本研究将观察anti-VEGF在淋巴管和淋巴结是否也发挥靶向作用，并评估其在导向UCPnano显示肿瘤淋巴结转移中的准确性。 本研究拟选用生物素（biotin，Bt）－亲和素(avidin，Av)系统（BAS）将UCPnano颗粒与VEGF偶联。它具有亲和力高，稳定性好，对结合物的原始生物活性无不良影响，放大作用等特点。 （3）有机化和靶向包被UCPnano标记肿瘤的评价 三步法放免预定位技术是较为成熟的一种定位方法。具体做法是在注射生物素化单抗后，用avidin结合标定的单抗并追捕游离单抗加速其排泄，再给予核素标记生物素。此方法中BAS的放大作用可以提高肿瘤内放射性核素的摄取量，标记生物素的快速血液清除可保证高瘤/血比。本研究也拟用UCPnano替代放射性核素，运用三步法预定位技术原理实现肿瘤术中显像。 为明确肿瘤范围，实现有效对照，本研究拟用荧光素酶（firefly luciferase，FLuc）报道质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞，筛选稳定表达的细胞，注入裸鼠体内，建立移植瘤模型。利用荧光素酶和底物的自发光效应准确显示肿瘤侵犯区域和淋巴结转移。 当前基于肿瘤模型对肿瘤研究的主要方法还局限于肉眼观察、处死实验动物后的肿瘤体积测量、称重及组织学切片观察等。本研究采用的活体动物体内生物成像技术，使研究者可以实时监测和记录在活体中的肿瘤细胞的活性和动向，记录发光强度，进行统计学分析，较传统方法具有显著的优越性。 三、研究内容与主要实验方案 （1）对UCPnano进行有机物包被，制备UCPnano-biotin，检测其特性。 （2）用生物素（biotin）标记anti-VEGF，鉴定其免疫活性。 （3）用荧光素酶报道质粒转染癌细胞，筛选稳定表达的细胞，接种裸鼠，建立移植瘤淋巴结转移模型。 （4）将anti-VEGF-biotin与UCPnano-biotin标定在肿瘤细胞上：①在红外线激发下在小动物成像仪中检测、记录肿瘤范围；②注入荧光素酶底物，比较肿瘤范围；③病理检查。 四、本项目特色与创新之处 1、项目特色 （1）生物技术研究领域有多种可见光－荧光发光物质标记物，包括荧光蛋白、荧光素酶、量子点以及有机染料如异硫氰酸、罗丹明、Cy3、Cy5等。有机染料和荧光染料具有很多缺点；量子点虽然具有传统荧光染料无法比拟的荧光特性，但它的生物兼容性及生物安全问题仍局限其广泛运用。 本课题组成功制作的粒径小于10nm的UCP纳米颗粒（UCPnano），属国际领先技术，经物理学检测，发光性能良好，在980nm波下激发下，发射波长从300~750nm的任意窄波长的UCP颗粒均已成功制备，对比文献，这些均属国际领先技术，在生物标记领域有巨大的应用潜力和广泛的适用范围。 （2）将anti-VEGF作为靶向制剂，引导UCPnano进行特异性肿瘤标记，不仅可以对肿瘤进行特异性标记，同时有望标记转移的淋巴结，为进一步观察淋巴结转移提供参考。 （3）选用生物素-亲和素系统（BAS）将UCPnano颗粒与anti-VEGF偶联，运用三步法预定位技术原理实现肿瘤术中显像。亲和素对生物素的亲和力高，稳定性好。生物素对结合物生物活性无不良影响。三步预定位法可以实现多级放大效应，提高术中可见光强度。 （4）通过文献查阅我们发现，在使用荧光染料作为标记物时研究人员并没有特殊使用靶向制剂，在没有靶向引导的情况下荧光染料富集于肿瘤组织的原理还不清楚。为此本课题设置U组，既将有机物包裹的ZrO2-UCPnano-NH2直接静注到人乳腺癌裸鼠原位移植瘤淋巴结转移模型小鼠中，以明确UCPnano是否也能在肿瘤组织中富集及其光线强度。 2、创新性 （1）目前报道的运用于生物学的UCP颗粒均属微米颗粒，在生物标记时对靶物质的影响较大。本课题组已经制作了粒径小于10nm的UCPnano，物理性能更优，对靶物质影响更小，对比文献，属国际领先技术。 （2）目前还没有UCPnano的实用生物学标记技术，本研究旨在设计一种普适的方法加工UCPnano，使其不但具有亲水性，还能与有机分子结合，便于生物标记，属创新研究。 （3）本研究将评价有机物包被后的ZrO2-UCPnano的光学特性、生物安全性，在细胞内和动物体内成像，并结合活体生物体内成像技术观察其在动物体内分布、移行及排泄并测定其浓度变化，为其在生物学的广泛应用奠定基础。 （4）将可见光标记物应用于肿瘤术中定位显像，具有完全自主创新性。 研究发现荧光染料用于术中定位，不仅能够准确显示肿瘤边界，而且对于癌前病变和小结节的敏感性高于传统影像学方法。利用荧光染料，可以减少肿瘤残留、保护正常组织，从而提高患者术后生存期。 ZrO2-UCPnano在红外线激发下可以发出可见光，且光学性能优于荧光染料。将其引入肿瘤手术，术者可以用肉眼观察，避免打扰手术进程，同时克服了荧光染料的固有缺点。此研究尚未见相关报道，属源头创新。 现有的检测淋巴结转移的方法前哨淋巴结活检术（SLNB）操作繁琐且准确性受到多种因素的影响。在利用荧光染料术中显像的研究中缺乏对淋巴结转移的关注。本课题探索用anti-VEGF靶向引导UCPnano显示转移淋巴结的准确性，也属创新研究。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 一、研究目的 建立上转化纳米颗粒（UCPnano）生物标记技术，评价生物化UCPnano的特性；用其显示肿瘤边界，指导手术，为肿瘤的诊断、治疗提供新的技术手段。 二、研究思路 UCPnano在980nm激发波长下发可见光，将其有机化并加挂特异抗体，可为肿瘤标记和定位提供便利，以辅助肿瘤手术。 三、创新点 目前报道的UCP颗粒属微米颗粒，本课题组已制作粒径小于10nm的UCPnano，属国际领先技术；目前无UCPnano的实用生物学标记技术，本研究旨在设计一普适方法加工UCPnano，属创新研究；本研究将评价生物化UCPnano的特性，为其在生物学应用奠定基础；将可见光标记物用于肿瘤定位，具有完全自主创新性。 四、技术关键 1.UCPnano与肿瘤相关抗体的生物素化。 2.生物素化UCPnano及肿瘤相关抗体的性状评价。 3.UCPnano标记肿瘤在体应用评价。 五、主要技术指标 1.有机物包被UCPnano，制备UCPnano-biotin，检测其特性。 2.用生物素（biotin）标记anti-VEGF，鉴定其免疫活性。 3.用荧光素酶报道质粒转染癌细胞，筛选稳定表达的细胞，接种裸鼠，建立移植瘤淋巴结转移模型。 4.将anti-VEGF-biotin与UCPnano-biotin标定在肿瘤细胞上：①在红外线激发下在小动物成像仪中检测、记录肿瘤范围；②注入荧光素酶底物，比较肿瘤范围；③病理检查。
科学性、先进性
- 1、上转化发光技术（UPT）的优点显示了其很好的生物学应用前景，但目前在生物学的运用研究仅限细胞或动物上简单尝试。本课题组成功制作的粒径小于10nm的UCPnano，属国际领先技术。经物理学检测，发光性能良好，在980nm波下激发下，发射波长从300~750nm的任意窄波长的UCP颗粒均已制备，对比文献，均属国际领先技术，在生物标记领域有巨大的应用潜力和广泛的适用范围。 2、将anti-VEGF作为靶向制剂，引导UCPnano进行特异性肿瘤标记。VEGF对血管增生活跃的肿瘤组织有特异性。VEGF家族的VEGF-C、VEGF-D及VEGFR-3与肿瘤淋巴管播散转移和预后密切相关。利用anti-VEGF作为靶向制剂，不仅能对肿瘤进行特异性标记，还有望显示转移的淋巴结。 3、选用生物素-亲和素系统将UCPnano颗粒与anti-VEGF偶联，亲和力高，稳定性好。运用三步法预定位技术原理实现肿瘤术中显像，具有多级放大效应，保证高瘤/血比，从而提高术中可见光强度。
获奖情况及鉴定结果
- 课题处于实验研究阶段。
作品所处阶段
- 实验研究阶段。
技术转让方式
- 申请专利后，以专利转让方式应用推广。
作品可展示的形式
- 现场演示
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 上转化颗粒在生物学的应用在国际范围内仅有初步应用的报道，所采用的颗粒未达到纳米级。本课题的技术要点是将纳米级上转化颗粒进行生物化修饰，使之具备生物兼容性，并评价其特性，为其在生命科学领域的广泛应用奠定基础。进而用肿瘤相关抗体标记生物化修饰后的上转化纳米颗粒，实验性应用于显示小鼠移植瘤的肿瘤边界和转移淋巴结，以期指导临床完整地切除肿瘤组织且最大限度地保护正常组织，并为综合治疗方案和预后提供参考，同时为肿瘤的诊断和治疗提供新的技术手段。 本研究高度创新并具有很好的实用价值；该技术不仅可以应用于临床，也可以广泛应用生命科学基础研究，具有极好的推广前景。
同类课题研究水平概述
- 1、肿瘤的手术治疗 手术切除是恶性肿瘤根治性治疗的最重要手段，在术中准确判断肿瘤侵犯范围和淋巴结转移情况有重要意义。 术中冰冻切片是目前使用广泛的术中病理诊断方法，但需等待时间长，结果受病理医生的经验影响大，且部分组织不宜做冰冻切片。淋巴结转移是影响手术治疗预后的重要因素，但不易识别。前哨淋巴结活检术是目前预测淋巴结转移状态的常用方法，但它操作耗时，在淋巴结跳跃式转移时受限。 有报道用氨基乙酰丙酸荧光导向显微手术切除胶质瘤能减少肿瘤残留并提高患者生存期。另有用吲哚青绿荧光染料引导肝癌的切除，术后病理证实术中荧光边界与病理边界相一致。用荧光引导肿瘤切除使术者易于观察肿瘤边界，不足是需借助仪器观察，且荧光物质固有缺点限制其运用。 2、目前常用的发光标记物 生物技术研究领域现有可见光－荧光发光物质标记物包括荧光蛋白、荧光素酶、量子点以及有机染料。 绿荧光蛋白（GFP）是最常用的荧光蛋白，但其需激发光才能发荧光，而且绿色荧光在活体内穿透性较差。有研究将含红荧光蛋白DNA质粒转染癌细胞，注入小鼠皮下制作转移瘤模型，观察到随时间推移出现的肿瘤增长和转移。量子点（QD）技术是近年发展的荧光标记技术，具有传统荧光染料无法比拟的优点，在生物技术领域将其作为探针有广泛的应用。有报道将其用于肿瘤血管体内显影和显示脑胶质瘤的范围。QD局限性是具有背景自发荧光干扰、活体组织光损伤、生物兼容性相对差等。 3、上转化颗粒（UCP）的发光特点 上转换荧光成像技术（UPT）是基于上转换发光材料发展的一种新型标记技术。UPT有光亮度强、稳定性好、对活体组织无光损伤、探测灵敏度极高、在生物组织中穿透性好等特点。据文献检索，UPT在生物学的运用研究报道仅限细胞或动物上的简单尝试，以证明其在生物运用上的可行性及发射荧光的优越性，这些实验都证明了UPT在生物运用上具有巨大的潜能。 4、上转化纳米颗粒（UCPnano） 本课题组与某大学激光应用研究所合作，研究UPT在生物学的应用。对比文献，本课题组制作的粒径小于10nm的UCPnano，经检测，发光性能良好，在980nm波下激发下，发射波长从300-750nm的任意窄波长的UCPnano均已成功制备。目前尚未见文献有类似报道，属国际领先。
