基本信息
- 项目名称：
- 在油/水两相界面中利用酶抑制法检测有机磷农药
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 食品和环境中的残留农药严重危害人们的健康，快速检测有机磷和氨基甲酸酯农药具有广泛的应用前景。此外，有机相体系中的酶催化反应是研究的热点,多数农药难溶于水,研究有机相存在条件下的胆碱酯酶活性及其抑制具有重要的意义。根据农药、底物和产物以及酶本身的溶解性,巧妙设计两相体系,使油相中的农药和底物在油/水界面上和胆碱酯酶作用,生成水溶性的产物进入水相并给出电化学信号。将有机磷农药加入到有机相中，会抑制两相界面中酶的活性。通过电化学信号的变化直接检测农药对酶的抑制程度，检测农药浓度范围在50ng/ml~100ug/ml之间。 研究胆碱酯酶在有机溶剂存在条件下的生物催化和抑制有助于建立农药残留快速检测新技术,是有机相酶学的深入,具有一定的科学意义。此外，胆碱酯酶抑制法和方波伏安技术相结合检测有机磷农药的含量的方法，具有仪器设备简单、分析速度快、灵敏度高、检测速度快、背景信号低等优点。研究具有重要的应用前景。
- 详细介绍：
- 随着农业发展，农产品生产越来越依赖于农药的使用，农药的不合理使用使得水体、土壤和农产品污染严重超标，农药残留引起的中毒事故频繁发生。我国农产品往往因农药残留超标难以跨越国外“绿色壁垒”，给企业带来巨大的经济损失。为了保障人民的身体健康，满足进出口贸易的需要，研究农药残留速测技术具有重要的意义。 用于农药残留检测的方法有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、色质联用法、毛细管电泳等。多数检测方法仪器昂贵、操作繁琐、耗时长、需要专业人员操作，难以满足现场快速检测的实际需要。有机磷和氨基甲酸酯农药能强烈抑制胆碱酯酶的活力，抑制率与农药浓度正相关，常常用于农药残留快速检测。它能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，缩小定量检测范围，是复杂的实验室方法的有效补充。利用酶抑制原理检测农药残留常常采用速测卡和比色法。其中速测卡不能定量，比色法灵敏度较低、不便于微型化。 通常胆碱酯酶在水相中行使催化性能，但是多数农药不易溶于水，需要用有机溶剂提取和富集，研究有机相条件下的胆碱酯酶活性及其抑制具有重要意义。反应池中上层为异辛烷的油相，其中有浅黄色的靛酚乙酸酯；下层水相，溶有胆碱酯酶，在两相界面上胆碱酯酶将上层中的靛酚乙酸酯催化成水溶性靛酚，进入下层，从而使上层浅黄色褪去，下层变成红色。加入甲基对硫磷农药时，胆碱酯酶活性受到抑制，上下层的颜色变化程度被抑制。在水相中插入电极检测其电化学信号的改变。酶的浓度逐渐增加，颜色变化逐渐增强。没有酶存在，上下层颜色不变化。酶浓度很高时，上层大量的靛酚乙酸酯被水解，颜色退去，水解产物靛酚进入下层颜色变红。 将电极插入到水相中，用循环伏安法研究反应过程。胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯水解产生靛酚，没有酶存在时，只有靛酚乙酸酯的一对氧化还原峰PI; 酶浓度很高时，靛酚乙酸酯完全水解，他的氧化还原峰PI消失，出现产物靛酚的氧化还原峰PII; 通过研究不同浓度的酶，我们清楚地看到这个变化的过程。通常胆碱酯酶在水相中行使催化功能，这里的结果意味着胆碱酯酶在油/水两相界面上仍然具有活性，可以在有机相条件下进行农药残留的检测。 为了选择合适的靛酚乙酸酯浓度，我们研究了这个浓度的影响。浓度过低，酶催化很慢，颜色几乎不变，浓度较高，反应速度加快，颜色变化明显。电化学信号也给出相似的结论，靛酚乙酸酯浓度越高，产物靛酚的电化学信号越高（酶浓度高，所以只有靛酚的一对峰）。 循环伏安法是研究物质氧化还原特性的工具，但不适合定量分析。我们采用方波伏安法定量研究农药对胆碱酯酶的抑制关系。（方波伏安法信号灵敏，检测速度快，一个读数只要几秒时间（循环伏安需要几分钟或更长），能够自动扣除背景。） 农药浓度很高时，酶几乎完全被抑制，只有靛酚乙酸酯的电化学信号；没有农药时，所有靛酚乙酸酯被水解为靛酚，只有靛酚的电化学信号；中间浓度的农药既有靛酚乙酸酯的信号，也有靛酚的信号，用两者峰电流比值表示酶活力, 农药对胆碱酯酶的抑制率则表示为这个比值的下降百分比。最终发现农药在高浓度范围时其抑制率与农药浓度成正比，在低浓度时其抑制率与农药的Ln值成正比，检测下限为50 ng/ml。 通常认为胆碱酯酶在水相中行使催化功能，研究发现胆碱酯酶在油/水两相界面上具有活性，工作是有机相酶学的深入，意味着农残检测能够在两相中进行，检测更加方便、灵敏。此外，采用电化学方法研究两相界面中的胆碱酯酶活性及其抑制，有助于便携式农药残留传感技术的发展，具有广泛的应用前景。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 农业生产中农药的不合理使用,带来环境和食品的污染,为了保障人民身体健康和生命安全,农药残留检测至关重要。有机磷农药能抑制胆碱酯酶活力,常用于农药残留的快速检测。研究思路是采用不相溶的两相,上层有机相溶有靛酚乙酸酯,下层水相溶有胆碱酯酶,在两相的界面上靛酚乙酸酯被酶水解成水溶性的靛酚,扩散到水中,发生电信号的改变。有机相中的有机磷农药会抑制两相界面上酶的活性,通过电化学信号的变化检测农药的浓度。
科学性、先进性及独特之处
- 有机相体系中的酶催化反应是研究的热点,多数农药难溶于水,研究有机相存在条件下的胆碱酯酶活性及其抑制具有重要的意义。根据农药、底物和产物以及酶本身的溶解性,巧妙设计两相体系,使油相中的农药和底物在油/水界面上和胆碱酯酶作用,生成水溶性的产物进入水相并给出电化学信号。研究胆碱酯酶在有机溶剂存在条件下的生物催化和抑制有助于建立农药残留快速检测新技术,是有机相酶学的深入,具有一定的科学意义。
应用价值和现实意义
- 不合理使用农药造成环境和农产品的严重污染。为了保障人民身体健康,满足进出口贸易需要,大力开展农药残留检测技术,监测环境农药污染、控制农产品中的农药残留至关重要。将胆碱酯酶抑制法和方波伏安技术相结合检测有机磷农药的含量,具有仪器设备简单、分析速度快、灵敏度高、选择性好等优点,对于合理使用农药,维护食品安全,保护生态环境,保障人类健康,避免和减少不必要的农业损失等都具有重要的现实意义。
学术论文摘要
- 有机磷和氨基甲酸酯类农药是我国农产品生产中使用的主要产品，低浓度的有机磷农药和氨基甲酸酯农药能强烈抑制胆碱酯酶的活力，一直被用作环境中有机磷和氨基甲酸酯农药污染快速检测的专用方法。然而，一个最大的问题是这两类农药几乎都是不溶于水的。研究有机相存在条件下的胆碱酯酶活性及其抑制具有重要的意义。 大部分有机磷毒剂和胆碱酯酶的底物是不溶于水的，而酶是两亲性的，能够分布到两相体系的界面上。研究表明靛酚乙酸酯的水解产物靛酚溶于水，通过界面进入水相，显示出很好的电化学信号。本试验利用方波伏安法检测农药对胆碱酯酶的抑制率。 研究得知：底物靛酚乙酸酯本身具有良好的电化学响应，尽管靛酚乙酸酯易溶于异辛烷，但它在水中也有轻微的溶解，能自发的从有机相中渗透到水相中，最后达到平衡；随着酶反应的进行，底物信号逐步下降，产物信号逐步上升；原本上层的黄色变为无色溶液，而下层的无色透明水相变成红色。说明酶在两相表面具有活性，催化靛酚乙酸酯水解；水解反应还与水相体积有关，水相体积越小，其水解越容易达到平衡，因为小体积水相具有浓缩效应，增大产物的浓度；随着甲基对硫磷浓度的增加，酶活性几乎被完全抑制。
获奖情况
- 论文在国际刊物Electrochemistry Communications （影响因子4.186, I区）上发表，该刊是电化学领域的权威期刊: Square wave voltammetry assay of organophosphorus inhibition on cholinesterase in two phases of isooctane/water, Electrochemistry Communications 2009,11,1022-1025 获浙江得省第十一届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛一等奖。
鉴定结果
参考文献
- 1) 张千等,乙酰胆碱酯酶生物功能的研究进展及其应用，国外医学(卫生学分册), 3 (2008) 143 2) 郭晶等,乙酰胆碱酯酶的动力学机制及其应用，农药，46（2007）18 3) 张宗美等,蔬菜有机磷和拟除虫菊酯类农药残留研究,食品科学, 3 (2008) 426 4) 车军等,生物传感器在农药残留检测中的应用,河北农业科学, 2(2008), 6 5) 宛梅丹等,乙酸靛酚酯- 丁酰胆碱酯酶法农药残留快速检测反应体系, 华南农业大学学报, 2 (2008) 61 6) 王兆守等,农药残留检测新方法研究进展，化工进展, 27(2008) 1370 7) M. Rault et al., Dynamics of acetylcholinesterase activity recovery in two earthworm species following exposure to ethyl-parathion, Soil Bio. Biochem. 40 (2008) 3086 8) 刘薇等,非水介质中不同反应体系的酶促反应，化学通报 66(2003)W049-W055 9) F. J. Schenck et al., Determination of organochlorine and organophosphorus pesticide residues in eggs using a solid phase extraction cleanup, J. Agric. Food Chem., 2000, 48 (12), 6412 10)钱立立,农药残留的快速检测和前处理技术的研究,中国科学技术大学,2007年博士论文
同类课题研究水平概述
- 农药不合理使用带来了农产品中农药残留问题,危及人们的健康和生命安全,作为技术壁垒也严重影响着农产品贸易。出于保障消费者合法权益、增强农产品市场竞争力的需要,对农产品中农药残留进行科学检测至关重要。 早期农药残留量分析方法局限于化学法、比色法和生物测定法, 方法欠专一, 灵敏度低。后来,色谱技术的发展推动了农药残留分析的高速发展。目前常规的农药残留检测技术主要有：理化分析法、色谱技术、酶联免疫检测方法、荧光分析法等,但都存在耗时长、成本高等缺点,难以满足现场快速检测的实际需要。 有机磷农药对胆碱酯酶有抑制作用,其抑制率与农药的浓度呈正相关。酶抑制法的原理足利用这一反应特性,用滤纸片或电极作为载体,将胆碱酯酶吸附在上面,加入显色剂,如果酶的活性没有被抑制,则生成的产物可以使显色剂显色,如果被测样品中含有农药残留则酶活性被抑制不能生成水解产物,显色剂不显色,根据颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化,可判断足否存在有机磷农药。酶抑制法作为一种快速检测果蔬中农药残留的筛选方法,与传统的化学分析和仪器分析法相比,克服了分析时间长、成本昂贵等缺陷。它直接用抑制率高低来表示农药残留程度的大小,直观、简便、灵敏,并能在较短的时间内筛选出大量的超标样品,进而缩小定量检测范围,将一部分含农药残留量高的果蔬产品阻挡在市场之外,避免中毒事件的发生,以达到保护消费者身体健康的目的。 自从上世纪80年代发现酶在接近无水的有机溶剂中起催化作用以来,有机介质中的酶催化反应成为研究的热点,它具有许多优点：1）许多有机底物在有机溶剂中有较大的溶解度；2）在有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性比在水中有明显提高；3）在有机溶剂中某些反应过程的热力学平衡可以向期望的方向移动,可以发生水溶液中不可能进行的反应,而且还能抑制因水产生的负反应；4）在有机溶剂中酶分子构象表现出比在水溶液中更有刚性的特点,因而可以通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些选择性；5）产物的分离与纯化比在水中容易,另外酶不溶于有机溶剂有利于酶的回收与再利用等；6）无微生物污染。酶在有机介质中反应的研究在国内外引起广泛的重视,并取得可喜的进展。 研究胆碱酯酶在有机溶剂存在条件下的生物催化和抑制有助于利用胆碱酯酶抑制法建立农药残留快速检测新技术,是有机相酶学的深入,具有一定的科学意义。
