基本信息
- 项目名称：
- 快速检测肠出血性大肠埃希菌的纳米生物传感器研发
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本研究的对象是肠出血型大肠杆菌（EHEC）。EHEC具有起病急、传播快、涉及范围广的特点。本研究致力于快速检测EHEC的纳米生物传感器研发。 一方面利用超声乳化法以PCDA单体为原料获得实验所需的囊泡，作为信号传导装置。另一方面选取能与EHEC的脂多糖特异性结合的DNA寡核苷酸链作为识别元件。最后将氨基化适配体通过酰胺键修饰到囊泡表面，制得纳米生物传感器，最后利用比色从而检测EHEC。
- 详细介绍：
- 生物传感器是以抗体、酶等生物材料为识别元件，来特异地结合各种配体，通过信号传导装置将这些生物过程转化为电、光等信号，从而定性或定量地检测各种配体，因此本研究以EHEC特异性适配体作为识别元件，以PCDA纳米囊泡作为信号传导装置，组装成纳米生物传感器，通过比色直观地检测EHEC。 选择PCDA单体是因为其具有双亲性、聚合性和变色性。PCDA一端亲脂，一端亲水，中间是典型的丁二炔结构。这种双亲性分子易于制备成囊泡。我们将PCDA单体超声乳化成透明色，再用254 nm紫外照射至蓝色，获得实验所需的囊泡。另外，本研究选取能与EHEC的脂多糖特异性结合的DNA寡核苷酸链作为识别元件，通过截短E17F-72适配体，预测其二级结构，最终合成并用FITC荧光素标记。然后，我们将氨基化适配体通过酰胺键修饰到囊泡表面，此时，640 nm处的PDA特征吸收峰不变，260 nm 处出现DNA的吸收峰，证明组装成功。 制得后进行方法学的评价，分别对其稳定性、检测时间、灵敏度、特异性、准确度进行评价。对纳米生物传感器进行完善。 本研究构建的适配体-聚丁二炔纳米囊泡生物传感器有望成为病原菌POCT检测的新方法，而且更换适配体又可以应用于其他病原菌的检测，特别在疾病暴发的预防和农村基层医院等条件相对落后地区的病原菌检测方面具有很好的推广价值，是我国处理此类大规模突发流行病事件的有利工具。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 目的： 利用聚丁二炔材料，制备一种核酸适配体的聚丁二目的： 利用聚丁二炔材料，制备一种核酸适配体的聚丁二炔纳米生物传感器快速检测标本中的肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7。 基本思路： 一方面用聚丁二炔材料制成纳米囊泡，另一方面对已有的肠出血性大肠埃希菌适配体序列进行截短设计，并通过酰胺化反应修饰到PCDA纳米囊泡的表面，实现生物传感器的组装。利用比色来快速定性或半定量检测溶液中的EHEC，并进行方法学评价。 创新点： 1）构建用于快速检测肠出血性大肠埃希菌的纳米生物传感器，为临床、疫区EHEC的初筛提供新方法。 2）开发纳米生物传感器的化学组装技术，解决纳米生物传感器用于肠道病原菌的快速检测研究中的难题。 3）操作简便，检测时间短，灵敏度高，特异性强。 4）更换系统中的适配体就可以应用于其他病原菌的检测。 技术关键： 1）PCDA纳米囊泡的制备 2）表征肠道病原菌特异性功能分子的筛选与制备。 3）纳米生物传感器功能化组装。 4）肠道病原菌的快速检测传感器检测技术研究。 主要技术指标： 1）验证方法：激光共聚焦、透射电镜等方法对该法进行了验证。 2）检测时间：在2h内可实现检测。 3）灵敏度：传感器CR%值随着EHEC菌液浓度的增加逐渐增加，检测限为104CFU/ml。 4）特异度：与15中其他细菌均无交叉反应。 5）准确度：检测临床标本198例，该方法的假阳性率1.5%；假阴性率0%；准确率高达98.5%。
科学性、先进性
- 继1982年美国第一次暴发该病以来，EHEC在全球范围内已引发了数百起暴发事件，给人类健康和社会经济造成了重大威胁。为此，建立一种快速、灵敏度高及操作简便的检测方法尤为迫切。 目前传统的培养法耗时耗力，存在操作步骤繁琐、检测时间长等缺点。近年来，许多基于不同原理的检测方法得到长足的发展，出现了一些新兴检测方法，如分子生物学法、ELISA 法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪法及基因芯片法等，与传统方法相比，这些方法具有一定的优势，但同样也存在着较高的假阳性且需要配备专门的人员和仪器，操作复杂，限制了检验工作的准确和简便。 因此建立一个针对EHEC快速、简便、灵敏、特异的检测方法显得十分重要。本课题研究纳米生物传感器，它是材料科学和生物技术的有机结合，从而开发纳米生物传感器的化学组装技术，构建用于快速、高灵敏检测肠出血性大肠埃希菌的纳米生物传感器，这种新建立的实验方法，有望实现对临床、疫区EHEC的初筛及快速检测，为卫生检验、临床检验提供新方法。
获奖情况及鉴定结果
- 无
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 以专利转让
作品可展示的形式
- 实物、产品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 使用说明及技术特点和优势： 本产品EHEC O157: H7检测试剂盒主要用于临床定性检测大肠埃希菌O157: H7。检测时，取前处理好的粪便标本于试剂中，同时做空白对照、阴性对照和阳性对照，37℃孵育1h后，比色检测计算CR%值。CR%=15%为cut off值，当标本CR%值≥15%时，提示可能有大肠埃希菌 O157:H7感染。该技术具有操作简单、检测快速、灵敏度高、特异度强、准确度高、保存方便等特点。 适用范围及推广前景的技术说明及市场分析、经济效益预测： 本产品适用于临床定性检测大肠埃希菌EHEC O157: H7的粪便标本。 现在对于病原菌快速简便的检测，仍是临床上面临的一大难题。本产品方法操作十分简单，检测快速，可替代现有的检测方法，尤其对肠出血性大肠埃希菌暴发的预防方面以及农村基层医院、卫生防疫站等条件相对落后地区的病原菌检测方面具有很好的推广价值，是我国处理此类大规模突发流行病事件的有利工具。在国内外都具有广阔的社会应用价值和市场前景以及良好的应用转化前景。
同类课题研究水平概述
- 大肠杆菌是人及各种动物肠道中的常居菌，常随粪便从人及动物体内排出，广泛散播于自然界。它被用来作为饮用水或其他水源粪便污染的指标。大多数大肠杆菌菌株均是不致病的，但是某些致病性大肠杆菌，特别是肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic escherichia coli, EHEC）可以引起人类严重的肠道传染病，引起人们广泛的关注。 大肠杆菌的传统检测方法包括多管发酵法（multiple-tube fermentation, MTF）和滤膜法（membrane filter, MF）等，存在操作繁琐、检测时间长（一般需要24～72 h才能得到结果）等缺点，难以满足传染病的快速诊断和污染源的快速确定。近年来，许多基于不同检测原理的方法已得到长足的发展，比如分子生物学方法、免疫学方法、细胞学方法以及质谱法]等等。与传统方法相比，这些方法具有一定的优势，但所需的检测时间仍然较长，且需要昂贵的仪器。因此本研究的快速准确检测大肠杆菌的纳米生物传感器方法具有重要意义。 当前对于EHEC的检测，已有应用纳米金标记磁珠分离电化学检测DNA方法。以纳米量子点为DNA标记,夹心法为目标捕获方法,通过磁珠分离富集途径,利用电化学方法检测纳米金标记在碳电极表面的还原信号,建立纳米生物传感器检测技术。还有建立了一种采用电化学阻抗谱技术快速检测大肠杆菌O157:H7的生物传感器,它是通过石英晶体金电极表面附着一层蛋白A膜来固定抗体的。此外还有酶免疫传感器检测等方法。
