基本信息
- 项目名称：
- 重组人血管内皮细胞生长抑制因子rhVEGI-192A的制备新工艺研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 恶性肿瘤已超过心血管疾病成为人类健康的头号杀手。目前我国癌症患者人数还在不断地增加，恶性肿瘤已经对人类生存、社会经济造成了重大的威胁。传统化学药物、放射、手术等手段虽然有一定的治疗效果，但由于其高毒性、耐药性以及清除肿瘤的不彻底性，大多数恶性肿瘤的预后如总病死率和长期生存率等在过去十年内未出现明显改进。因此，针对恶性肿瘤的有效治疗，有赖于发现新治疗靶点和针对这些靶点的新治疗策略。血管内皮生长抑制因子（VEGI）是一种新发现的内源性血管新生拮抗剂，研究发现，VEGI通过抑制肿瘤中的新生血管发挥抗肿瘤作用，不但能够抑制肿瘤的生长，而且能使已经成形的肿瘤发生溃破和萎缩，而毒副作用较少。因此，VEGI有望开发成为一种高效低毒的抗肿瘤药物。本研究通过克隆和诱导表达一个重组人血管内皮细胞生长抑制因子拼接异构体rhVEGI-192A，摸索能增加其产量、纯度和活性的方法。通过诱导系统、宿主菌、诱导条件、纯化复性方法的优化，建立一个高效及稳定生产可溶性好、高活性、高纯度rhVEGI－192A重组蛋白的制备新工艺。并对其进行体内以及体外抗血管新生活性研究，为其作为临床药物开发打下基础。
- 详细介绍：
- 血管内皮生长抑制因子（VEGI）是一种内源性血管新生拮抗剂，本研究通过克隆和诱导表达一种重组人血管内皮细胞生长抑制因子拼接异构体（rhVEGI-192A），摸索能增加其产量、纯度和活性的蛋白表达纯化方法，并对其进行初步抗肿瘤活性研究，为其作为临床药物与工业化生产打下基础。 本研究通过比较采用IPTG诱导和自动诱导两种蛋白诱导体系，选用BL21 (DE3) pLysS和Origami B (DE3)两种宿主菌，选择不同诱导时间及诱导温度，以摸索诱导蛋白高效稳定表达最佳优化条件。结果发现采用自动诱导蛋白表达系统，在OrigamiB (DE3)菌株中于25℃下诱导24h能很大程度提高rhVEGI-192A蛋白的产量和活性。采用Ni-NTA柱金属螯合亲和层析技术和梯度透析复性方法获得了高纯度、可溶性好的蛋白。采用MTT比色试验法、Annexin V细胞染色和鸡胚尿囊膜血管新生实验分析重组蛋白的生物学活性，证明本课题系统性优化制备的rhVEGI-192A蛋白具有显著的体外抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡以及体内抑制血管新生的功效。因此，本研究成功建立原核体系自动诱导表达人重组蛋白VEGI-192A的制备新工艺。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 血管内皮生长抑制因子(VEGI)是一种内源性血管新生拮抗剂，本研究通过克隆和诱导表达一个重组人血管内皮细胞生长抑制因子拼接异构体rhVEGI-192A，摸索能增加其产量、纯度和活性的方法。通过诱导系统、宿主菌、诱导条件、纯化复性方法的优化，建立一个高效及稳定生产可溶性好、高活性、高纯度rhVEGI-192A蛋白的制备新工艺。并对其进行体内以及体外抗血管新生活性研究，为其作为临床药物开发打下基础。
科学性、先进性及独特之处
- 本课题首次将自动诱导技术应用于VEGI重组蛋白的制备，成功建立一套稳定而高效的蛋白诱导优化系统和纯化复性方法。通过该工艺可制备高纯度、可溶性好、高活性的rhVEGI－192A蛋白，为临床药物开发打下基础。且该制备工艺操作简便，易于质量控制，经济成本及人力成本低，为rhVEGI-192A的工业化生产奠定基础。该项目具较强的创新性，科学研究意义较大，在研究成果市场化和产业化发展前景较好，应用价值颇高。
应用价值和现实意义
- 本研究的对象VEGI是一种新型的血管新生抑制剂。跟目前已经在临床上使用的贝伐单抗的抗肿瘤原理是相似的。VEGI不仅对多种肿瘤均有抑制效果，并且毒副作用低，可长期安全使用，从而有着巨大的临床应用前景。本研究建立了一个高效及稳定的自动诱导体系，可以为VEGI的新药临床试验提供足够量可溶性好和高活性的蛋白，而且本制备工艺操作简便，容易控制，成本低廉。因此这项研究有望创造巨大的经济和社会价值。
学术论文摘要
- 血管内皮生长抑制因子(VEGI)是一种内源性血管新生拮抗剂，本研究通过克隆和诱导表达一种重组人血管内皮细胞生长抑制因子拼接异构体(rhVEGI-192A),摸索能增加其产量、纯度和活性的蛋白表达纯化方法，并对其进行初步抗血管新生活性研究，为其作为临床药物与工业化生产打下基础。本研究通过比较采用IPTG诱导和自动诱导两种蛋白诱导体系，选用BL21(DE3)pLysS和OrigamiB(DE3)两种宿主菌，选择不同诱导时间及诱导温度，以摸索诱导蛋白高效稳定表达最佳优化条件。结果发现采用自动诱导蛋白表达系统，在OrigamiB(DE3)菌株中于25℃下诱导24h能很大程度提高rhVEGI-192A的产量和活性。采用Ni-NTA柱金属螯合亲和层析技术和梯度透析复性方法获得了高纯度、可溶性好的蛋白。采用MTT比色试验法、Annexin V细胞染色和鸡胚尿囊膜血管新生实验分析重组蛋白的生物学活性，证明本课题系统性优化制备的rhVEGI-192A具有显著的体外抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡以及体内抑制血管新生的功效。因此本研究成功建立原核体系自动诱导表达人重组蛋白VEGI-192A的制备新工艺。
获奖情况
- 本作品在第十届“挑战杯”聚晖广东大学生课外学术科技作品竞赛中获得一等奖。 我校第十届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛获得特等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Holleb AI, Folkman J. Tumor angiogenesis. CA Cancer J Clin, 1972, 22(4): 226-9. [2] Zhai Y, Yu j, Iruela Al, Huang WQ, et al. Inhibition of angiogenesis and breast cancer xenograft tumor growth by VEGI, a novel cytokine of the TNF superfamily . Int J Cancer 1999;82:131-6 [3] Zhai et al, A novel cytokine of the tumor necrosis factor family ,is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo. FASEB J 1999;13:181-9 [4] Hou W, Medynske D, Wu S, Lin X, Li LY. VEGI-192, a New Isoform of TNFSF15 , Specifically Eliminates Tumor Vascular Endothelial Cell and Suppresses Tumor Growth . Clin Cancer Res 2005,11(5):5595-5602 [5] Huang X, Wong MK, Zhao Q, Wang KZ,et al. Soluble recombinant endostatin purified from Escherichia coli: antiangiogenic activity and antitumor effect. Cancer Res. 2001 Jan 15;61(2):478-81. [7] F.William Studier. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.Protein Expression and Purification,2005 41:207-234
同类课题研究水平概述
- 血管内皮生长抑制因子（VEGI）是一种新发现的内源性血管新生拮抗剂，属于肿瘤坏死因子-15超家族成员，属Ⅱ型跨膜糖蛋白。1997年Tan等率先通过筛选人脐静脉内皮细胞cDNA文库发现了人VEGI，当时命名为TLI (TNF-like ligand 1)。随后的生物活性研究发现，VEGI具有明显抑制内皮细胞增殖的作用，并由此而得名。VEGI全长基因为17Kb，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个外显子和三个内含子构成。按不同的拼接方式拼接产生三种mRNA，分别编码由251、192、174个氨基酸残基组成的VEGI-251、VEGI-192和VEGI-174异构体。其中VEGI-192存在A、B两种亚型。研究发现，全长的VEGI-174的可溶性很差，导致其抗血管新生效应不佳。而体外表达纯化获得的VEGI-251重组蛋白几乎不具备抑制血管新生的功能，目前原因未究。在进一步的研究发现VEGI不只是特异性的作用于内皮细胞，它对于各种不同的肿瘤模型（其中包括乳腺癌、结肠癌等）都具有显著的抗肿瘤疗效。近年发现新的拼接异构体rhVEGI-192A的抗血管新生活性更强，体外实验表明rhVEGI-192A能显著抑制牛主动脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞的增殖。此外，rhVEGI-192A还能抑制内皮细胞形成血管状结构。体内实验研究显示，在鼠路易士肺癌同种移植C57BL/6小鼠肿瘤模型中，系统性腹腔注射rhVEGI-192A可有效抑制异体移植的肿瘤生长，肿瘤内血管化程度显著降低。且对肾脏、肝脏显示无毒性。同时作为血管内皮细胞自分泌的抑制因子，更具激活体内免疫系统的功效。这说明rhVEGI-192A有望成为一种广谱性的抗肿瘤药物。自动诱导表达技术是由pET系统的发明者Bill studier于2005年提出来的一种更有效的蛋白表达系统。这种自动诱导蛋白表达系统是建立在pET系统的基础上，主要是通过改变培养基的成分，达到不需额外添加诱导剂即能表达目的蛋白。自诱导pET系统采用的培养基中含有乳糖和葡萄糖。当葡萄糖存在时，乳糖不被利用，其蛋白表达诱导作用即被抑制。从而保证细菌可以在不表达外源性蛋白的情况下，爆发式生长。而当葡萄糖消耗尽时，乳糖代谢物发挥诱导作用，由于此时宿主菌密度相当高，但与IPTG诱导相比，总体蛋白产量普遍能提高几倍到几十倍。到目前为止，这种表达技术已经被很多的做蛋白结构研究的实验室所采用。
