基本信息
- 项目名称：
- 白松根特异启动子PmPsPR10-800驱动TaNHX2基因提高水稻耐盐性研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 液泡Na+/H+逆向转运蛋白在作物耐盐胁迫中起着重要的作用，提高Na+/H+逆向转运蛋白的表达对作物耐盐胁迫具有十分重要的意义。本文利用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和美洲东部白松(Pinus strobus) PR10基因启动子PmpsPR10的800 bp序列PmpsPR10-800，分别与来自小麦液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白基因（TaNHX2）构建成两个植物双元表达载体（35S::TaNHX2，PmPsPR10-800::TaNHX2），并转化水稻，以 CaMV35S启动子为对照，研究PmpsPR10-800对TaNHX2基因的调控效果。
- 详细介绍：
- 水稻是重要的粮食作物，盐渍胁迫是导致水稻减产的重要原因之一，培育和推广具有广泛适应性的水稻耐盐品种，是利用盐碱地的一条经济有效的途径。研究发现提高液泡Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达对作物耐盐胁迫具有十分重要的意义。本研究组前期的工作中，利用PCR方法从裸子植物美洲东部白松中克隆了PR10基因的启动子序列（PmPsPR10），利用5’末端删除，构建了启动子不同序列与GUS融合表达载体并转化烟草和拟南芥，进行高效表达启动子必需最短序列的确定，现已得到PR10基因的一个800bp序列PmPsPR10-800，发现该序列具有很强的根表达特异性，其活性比全长启动子PmPsPR10活性还高。 本研究利用裸子植物的白松根特异表达的800bp启动子片段(PmPsPR10-800)与耐盐相关基因TaNHX2 的嵌合表达载体，同时还构建了35S::TaNHX2表达载体,通过农杆菌法转化水稻，以研究TaNHX2 基因的耐盐机理、效果以及不同启动子对该基因表达的调控作用，以期得到高度耐盐的转基因水稻，提高盐碱地水稻的产量。PCR、Southern和Northern杂交结果表明：目的基因已经整合进入水稻基因组并已经在水稻体内得到表达。V-ATPase、V-Ppase 和P-ATPase的水解活性检测结果表明，PmPsPR10-800启动子能驱动TaNHX2 基因在根中特异性表达。耐盐性试验和农艺性状品比表明，转 PmPsPR10 -800::TaNHX2 植株能在150 mM NaCl盐池中正常生长，在100 mM NaCl盐池中正常结实；在50 mM盐池中，PmPsPR10-800::TaNHX2 水稻的田间表现、产量、抗性方面表现良好，具有推广价值。 中国是世界上的农业大国和植物基因工程发展较快的国家，研究该启动子在水稻中对于外源基因的调节作用和在水稻耐盐抗逆基因工程中的运用，具有重要的理论意义和应用价值。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本课题利用来自美洲东部白松PR10基因启动子PmpsPR10的800 bp序列和CaMV 35S启动子分别与来自小麦液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白基因（TaNHX2）构建植物双元表达载体并转化水稻，研究PmpsPR10-800启动子调控TaNHX2基因耐盐胁迫功能。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究首次将来自裸子植物白松PmpsPR10-800根特异表达启动子与小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因构建双元表达载体转化水稻，研究PmpsPR10-800启动子对TaNHX2基因的调控效果，为进一步开发利用PmpsPR10-800启动子抗逆基因资源奠定理论基础。
应用价值和现实意义
- 根特异的PmPsPR10启动子对抗逆基因TaNHX2的调控作用研究，对水稻耐盐抗逆基因工程育种具有重要的指导意义，有利于提高水稻抗盐胁迫能力，加快我国转基因耐盐水稻研究与产业化进程。
学术论文摘要
- 本文利用来自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和美洲东部白松(Pinus strobus) PR10基因启动子PmpsPR10的800 bp序列PmpsPR10-800分别与来自小麦液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白基因（TaNHX2）构建成两个植物双元表达载体（35S:: TaNHX2，PmPsPR10-800::TaNHX2）转化水稻，研究PmpsPR10-800对TaNHX2基因的调控效果。结果表明，松树PmPsPR10-800启动子能在根部特异性调控TaNHX2基因的表达。在150 mM NaCl胁迫处理下，转PmPsPR10-800::TaNHX2基因水稻根中的V-ATPase、V-Ppase 和P-ATPase酶活性显著高于转35S:: TaNHX2基因水稻和野生型水稻。与野生型植株相比，转PmPsPR10-800::TaNHX2和35S:: TaNHX2基因水稻株系对盐胁迫耐受能力均有不同程度的提高，在150 mM NaCl的盐池中全部生长良好，其中转 PmPsPR10-800::TaNHX2植株能在100 mM NaCl的盐池中正常结实。
获奖情况
- Zhou XM, Shi R, Xiang QQ, et al. 2009. Overexpression of TaNHX2 gene driven by Pinus strobus root specific promoter PmPsPR10-800 enhances rice salt tolerance.（submitted to Plant cell report）
鉴定结果
参考文献
- Apse M P, Aharon G S, Snedden W A, et al. Salt tolerance confereed by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiporter in Arabidopsis. Science, 1999, 285(5431): 1256-1258 Liu J J, Ekramoddoullah A K M, Piggott N, et al. Molecular cloning of a pathogen/wound-inducible PR10 promoter from Pinus monticola and characterization in transgenic Arabidopsis plants.Planta. 2005, 221: 159-169 Ohta M, Hayashi Y, Nakashima A, et al. Introduction of a Na+/H+ antiporter gene from Atriplex gmelini confers salt tolerance to rice. FEBS Letters, 2002, 532(3): 279-282 Sze H, Li X, Palmgren M G. Energization of plant cell membranes by H+-pumping ATPases: Regulation and biosynthesis. Plant Cell, 1999, 11: 677-689 Zhu J K. Plant salt tolerance. Trends in Plant Sci, 2001, 6(2): 66-71
同类课题研究水平概述
- 在高盐浓度下植物可以通过质膜和液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白，逆Na+ 浓度梯度将Na+ 运出细胞或将Na+ 区隔化在液泡内，以维持细胞质Na+ 稳态和Na+/K+ 比相对稳定，减少Na+ 对胞质中细胞器的毒害。同时，通过液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白把Na+ 区隔化入液泡，又降低了细胞的渗透势，促使细胞从外界胁迫环境中吸水以继续维持渗透平衡，具有调节细胞质内pH值和Na+ 浓度的功能。植物Na+/H+ 逆向转运蛋白活性首次在大麦中发现，其定位于质膜，主要与植物对Na+ 的外排有关，是植物抗拒盐离子毒害的首个屏障。在植物体内，质膜H+-ATPase利用水解ATP的能量把H+ 从细胞质中泵出细胞，产生跨膜的H+ 电化学势梯度，提供能量，驱动质膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白，使H+ 顺其电化学势进入细胞。同时Na+ 逆其电化学势排出细胞，以维持胞质内的低Na+ 水平。在植物中，Zhu等从拟南芥中克隆了SOS1基因(Salt Overly Sensitivity 1)，它编码一个质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白。该蛋白与细菌和真菌的质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白具有很高的同源性。此外，从蓝藻中克隆的质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白基因SynNhaP，可以恢复大肠杆菌NhaA，NhaB，ChaA突变体的盐敏感性表型，说明SynNhaP对在质膜上的Na+/H+ 交换，及对增强植物耐盐性可能具有重要作用。Apse和Zhang等在油菜和番茄中过量表达来自拟南芥液泡膜的Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1，发现油菜和番茄均能够在200 mM NaCl存在条件下生长和开花和繁殖下一代。在水稻中过量表达来自滨藜（Atriplex gmelini）液泡膜的Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AgNHX1发现，转基因液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白活性是非转基因的8倍，转基因水稻能够在300 mM NaCl条件下存活三天。为了使Na+/H+ 逆向转运蛋白在植物体内有效发挥作用，本研究首次将来自裸子植物白松PmpsPR10-800根特异表达启动子与小麦TaNHX2基因构建双元表达载体转化水稻，获得的耐盐性强的转基因水稻，研究结果对于加快我国转基因耐盐水稻研究与产业化进程，提高我国在该领域的自主创新能力，培育适宜在盐碱地种植的水稻优异品种具有重要意义。
