基本信息
- 项目名称：
- 马氏珠母贝抗菌肽的分离纯化及其活性分析
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 马氏珠母贝是用于海水珍珠生产的主要种类，具有重要的经济价值。然而，在当前马氏珠母贝养殖中，病害日益严重和养殖珍珠质量持续下降等问题使海水珍珠产业的发展面临着巨大困难，为了避免由于过量及反复使用抗生素和化学药物导致的耐药性、药物残留和污染环境等问题，对寻求控制马氏珠母贝病害和提高珍珠养殖质量的合适方法，本研究从分析马氏珠母贝非特异性免疫因子——抗菌肽着手，采用冰醋酸抽提技术、DEAE Sephadex A-50 和 Sephadex G-75离子层析技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，分离纯化出具有广谱高效的天然抗菌肽，并对其抗菌活性、抗菌谱和分子结构进行了初步研究和鉴定。本研究不仅为开发利用马氏珠母贝抗菌肽、克隆cDNA以及分子表达提供一定前期基础，同时也为研究和开发水产养殖动物病害防治新药提供了一个崭新的视野和模式。
- 详细介绍：
- 抗菌肽（antimicrobial peptides）是生物体免疫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的肽类活性物质，是生物体重要的非特异性免疫因子，不仅具有广谱的抗菌活性，还有明显的抗病毒、抗丝状真菌和抗原生动物类寄生虫等作用，有些还能在不影响动物体正常细胞的情况下选择性杀伤肿瘤细胞以及抑制乙肝病毒的复制等。由于抗菌肽具有作用迅速、抗病原能力强、抗病原谱广、活性稳定、不易产生耐药性以及耐高温和耐高盐等特点，其作用机制具有抗生素无法比拟的优越性，被认为是最有可能替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物，目前已成为免疫学、分子生物学、药学和食品科学等领域的研究热点。 由于水生无脊椎动物缺乏特异性免疫功能，它们对外来病原的防御只能完全依靠非特异性免疫系统，在这种情况下，其体内的各种非特异性免疫因子对其保持健康的作用要比脊椎动物更为重要。已有研究表明，抗菌肽作为重要的非特异性免疫因子，其在水生生物特别是水生无脊椎动物中的数量和种类比陆生动物更加丰富，活性也更强。在海南，马氏珠母贝已被确定为优先发展的五大支柱性水产养殖品种之一，然而对其抗菌肽的类型、活性以及抑菌作用尚未见系统的研究报道。本文采用冰醋酸提取法分离获得了抗菌肽，并对所分离的抗菌肽的理化性质和抑菌活性进行了分析。 1. 马氏珠母贝抗菌肽的分离纯化 将马氏珠母贝的鳃，匀浆后取上清液。利用DEAE Sephadex A-50 和 Sephadex G-75，对匀浆物进行分离纯化。 经 DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析，共得到五个组分峰，经抗菌活性粗筛，洗脱峰第Ⅴ峰(收集管74-81)抗菌活性较强。将该组分峰收集后进一步用Sephadex G-75凝胶过滤层析分离，共得到两个组分峰，其中第Ⅱ峰(收集管100~102)抗菌活性较强。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳图谱显示为单一的蛋白质条带，分子量约30 000 Da，将其命名为PM-AMP。 2. 马氏珠母贝抗菌成分的抗菌活性研究 用纸片琼脂扩散法测定了马氏珠母贝鳃粗提取物的抗菌活性。测试菌株包括革兰氏阴性菌，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)和革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。实验结果显示，当样品浓度为OD280＝1.3时，对革兰氏阴性菌除副溶血弧菌的抑菌圈直径达9mm外，对其它各菌抑菌圈直径达均11mm以上。对革兰氏阳性菌，金黄葡萄球菌的抑菌圈直径达10mm，但对枯草芽胞杆菌无抑制作用。利用微量稀释法测定纯化的PM-AMP对以上各菌的抑菌活性。实验结果表明，PM-AMP具有广谱抗菌活性，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有明显的抗菌作用，但对枯草芽胞杆菌无抑制。 用微量稀释法分别测定了纯化的抗菌肽最低抑菌浓度MIC（μmol/L），抗菌肽对4种标准菌株大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、嗜水汽单胞菌、金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌的MIC（μg/mL）分别为100μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和750μg/mL。可见PM-AMP对不同细菌的抑菌率和最低抑菌浓度（MIC）明显不同，对革兰氏阴性菌的抗菌效果明显较革兰氏阳性菌强。溶血实验结果显示，PM-AMP具有较弱的溶解鱼红细胞的作用，具有一定的应用前景。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 在水产动物疾病防治上，随着抗生素等化学药物反复使用次数的增多和用量的加大，产生的毒副作用如药物残留、耐药性和污染环境等问题阻碍了水产养殖业的可持续性发展。本作品就是为了寻求控制马氏珠母贝病害和提高珍珠养殖质量的合适方法，从生物自身免疫能力入手，对生物体本身具有的非特异性免疫因子——抗菌肽进行分离纯化，以期找到抗生素的替代品用于水产养殖动物病害的防治，提供一个开发和研究新药的崭新视野和模式。
科学性、先进性及独特之处
- 抗菌肽具有作用迅速、抗病原能力强、抗病原谱广、不易产生耐药性等特点，被认为是替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物。水生无脊椎动物由于缺乏特异性免疫功能，其体内的各种非特异性免疫因子，尤其是抗菌肽对其保持健康比陆生动物更为重要。已有研究表明，抗菌肽在水生无脊椎动物中的数量和种类比陆生动物更加丰富，活性也更强，但对海洋无脊椎动物抗菌肽的研究报道并不多，对马氏珠母贝抗菌肽的研究更未见报道。
应用价值和现实意义
- 本项目研究不仅揭示了马氏珠母贝的部分免疫机制，为控制其病害和提高养殖珍珠质量探索合适方法奠定了基础，并且从马氏珠母贝中发现和分离到了一种具有广谱抗菌活性，对多种已产生耐药性的水产动物病原菌以及人类致病菌具有杀灭或抑制作用的抗菌肽。该结果将可促进具有我国自主知识产权的新药（包括替代抗生素的新型水产药物和人用药物、抗肿瘤药物、水产饲料添加剂等）研究和开发，具有重要的理论和实际意义。
学术论文摘要
- 马氏珠母贝是海南省优先发展的支柱水产品种之一，对水产养殖业的发展起着重要的作用。近年来，由于马氏珠母贝病害日益严重，使得该产业的发展面临着巨大困难。为了寻求控制马氏珠母贝病害和提高珍珠贝养殖质量的合适方法，本研究从分析马氏珠母贝非特异性免疫因子——抗菌肽着手，利用冰醋酸抽提技术、DEAE Sephadex离子层析技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，分离纯化出具有广谱高效的天然抗菌肽，并对其抗菌活性、抗菌谱和分子结构进行了初步研究和鉴定。本研究不仅为开发利用马氏珠母贝抗菌肽、克隆cDNA以及分子表达提供一定前期基础，同时也为研究和开发水产养殖动物病害防治新药提供了一个崭新的视野和模式。
获奖情况
- 2009年5月获得某校“挑战杯”大学生课外科技作品竞赛一等奖。
鉴定结果
参考文献
- ［1］Iijima R, Kisugi J, Yamazaki M. A novel antimicrobial peptide from the sea hare Dolabella uricularia[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2003, 27:305-311. ［2］Matsuzald K., Murase O., Fujii N., et al.. An antimicrobial peptide, magainin 2, induced rapid flip-flop of phospholipids coupled with pore formation and peptide translocation[J]. Biochemistry, 2003,35:11361-11368. ［3］Reddy P S & Reddy P R. Purification of molt-inhibiting hormone-like peptides with hyperglycemic activity from the eyestalks of the crab Scylla serrata[J]. Fisheries Science, 2006, 72: 415-420. ［4］Seo J K, Crawford J M, Stone K L, et al. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster Crassostrea virginica[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2005, 338:1988-2004. ［5］Silphaduang U, Noga E J. Peptide antibiotics in mast cells of fish[J]. Nature, 2001, 414:268-269
同类课题研究水平概述
- 抗菌肽是生物体免疫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的肽类活性物质，具有作用迅速、抗病原能力强、抗病原谱广、活性稳定、不易产生耐药性以及耐高温和耐高盐等特点，其作用机制具有抗生素无法比拟的优越性，被认为是最有可能替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物。自1972年瑞典科学家Steiner等人分离获得cecropin以来，多种抗菌肽相继被分离纯化。迄今为止，已从哺乳动物、植物、昆虫、两栖、水生动物甚至微生物中分离纯化出800多种。不过，目前所分离获得的抗菌肽主要来自于陆生生物，水生动物中分离的抗菌肽不到200种，从海洋生物中分离出的抗菌肽则更少，这可能是由于海洋生物抗菌肽的分离纯化工作起步较晚造成的。 自1988年Nakamura等从鲎（Tachpleus tridentatus）中分离获得鲎素（Tachyplesin）后，海洋生物在抗菌肽分离纯化方面开始受到重视。由于水是许多病原微生物生长繁殖的适宜场所，因此水生生物比陆生生物更容易受到病原的侵袭；特别对于水生无脊椎动物而言，由于缺乏特异性免疫功能，它们对外来病原的防御只能完全依靠非特异性免疫系统，在这种情况下，其体内的各种非特异性免疫因子对其保持健康就更为重要。已有研究表明，抗菌肽作为重要的非特异性免疫因子，其在水生生物特别是水生无脊椎动物中的数量和种类比陆生动物更加丰富，活性也更强。不过，目前仅对几种海洋软体动物抗菌肽进行了研究，如截尾海兔（Dolabella auricularia）、紫贻贝（Mytilus edulis）、地中海贻贝（mediterranean mussel）、巨牡蛎（Crassostrea gigas）和美洲牡蛎（Crassostrea virginica），分离获得的抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、病毒、真菌以及原生动物寄生虫等表现出不同的活性。因此，对海洋软体动物抗菌肽进行广泛的研究，研究结果不仅可为控制海洋生物病害和提高养殖品种质量探索合适方法，还有助于发现具有较强活性的新型抗菌肽类，推动具有我国自主知识产权的新药（包括替代抗生素的新型水产药物和人用药物、抗肿瘤药物、水产饲料添加剂等）研究和开发，具有重要的理论和实际意义。
