基本信息
- 项目名称：
- rhFGF-1ser98,132的定点化学修饰及修饰产物活性和稳定性研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 重组人成纤维细胞生长因子-1（rhFGF-1）作为一种重要的功能蛋白，长期的研究和实践表明，其对各类创伤及溃疡，尤其是大面积创面具有突出的促愈合作用。同时，临床实践还表明，FGF-1对心肌梗死、糖尿病并发的下肢溃疡、神经退行性疾病等均具有重要的作用。然而，rhFGF-1存在体外稳定性差、体内半衰期短的缺陷日益构成该药产业化应用的“技术瓶颈”。本课题采用化学修饰剂聚乙二醇（PEG）定点修饰突变体rhFGF-1ser98,132，可以增强rhFGF-1的生物稳定性，延长体内半衰期，降低免疫原性。为开发稳定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制剂奠定基础。
- 详细介绍：
- rhFGF-1作为一种重要的功能蛋白，其部分制剂已经上市并产生了可观的经济和社会效益，但该类生长因子新药作为蛋白药物，稳定性差、体内生物半衰期短也一直是临床使用过程亟待解决的难题。课题组在前期研究工作基础上提出了以聚乙二醇（PEG）为化学修饰剂对rhFGF-1进行化学修饰，以期获得稳定性和安全性好的新型蛋白药物的新思路。更为关键的是，课题组认识到，长期以来，蛋白质的定点修饰一直是科学研究热点，这是因为随机的化学修饰会增加后续样品纯化的复杂性。通过对hFGF-1的结构分析发现其一级结构中共含有三个半胱氨酸（Cys）残基，分别位于第31，98，132位，第98位和第132位半胱氨酸对于维持蛋白质的活性是不必需的，因此本课题组创造性的采用基因工程方法用中性氨基酸如：丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）取代Cys，构建了活性保存率好的突变体rhFGF-1ser98,132。通过离子交换、肝素亲和两步层析纯化，获得了促Balb/c 3T3细胞增值活性与天然hFGF-1对照品相似的rhFGF-1 ser98,132突变体纯品，并用20kDPEG-马来酸酰亚胺酯对其进行定点化学修饰，修饰产物除保留了生长因子的促分裂活性外，在热稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、动物体内稳定性方面均有明显的改善。本课题为如何解决hFGF-1长期存在的稳定性差、具有免疫原性等临床缺陷提供了重要的方法；同时为改善和提高生长因子及其他蛋白药物的生物学性能提供了有效的理论和实验手段，具有较为重要的理论和现实意义；该项目的成功实施有望在世界上抢先获得专利并部分地代替现有产品。
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撰写目的和基本思路
- 与其他蛋白类药物一样，rhFGF-1也存在稳定性差、体内半衰期短的问题，同时，由于通常在构建过程中对其序列进行一定地改造，也使其在一定程度上存在免疫原性问题。用20kDPEG-马来酸酰亚胺定点修饰rhFGF-1ser98,132，可以增强其生物稳定性，延长体内半衰期，降低免疫原性。为开发稳定性更好、安全性更高的rhFGF-1新型制剂奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- 本课题属于自主创新类课题。hFGF-1第98位和第132位半胱氨酸对于维持蛋白质的活性是不必需的，因此创造性地采用PCR的方法获得了rhFGF-1突变体rhFGF-1ser98,132 ,并采用20kDPEG-马来酸酰亚胺成功实现了对rhFGF-1的定点化学修饰。通过上述修饰，获得的修饰产物不仅活性保存率高而且稳定性取得了较大地提高，有效克服了rhFGF-1蛋白稳定性差的缺陷。
应用价值和现实意义
- rhFGF-1可广泛用于治疗各类创伤、溃疡、神经损伤、眼科等疾病。但其稳定性差、半衰期短的缺陷却大大限制了其临床应用。经研究发现，经PEG修饰可以有效地提高蛋白的稳定性、延长体内半衰期。因此本课题拟采用PEG化学修饰拟实现FGF-1的高稳定性和延长半衰期无疑具有重要的意义。相信该课题的成功实施，必将为打破制约FGF-1产业化推广的关键技术“瓶颈”、拓展FGF-1的临床应用起到积极的推动作用。
学术论文摘要
- 题目：rhFGF-1ser98,132的定点化学修饰及修饰产物活性和稳定性研究 目的：用20kDPEG-马来酸酰亚胺定点修饰rhFGF-1ser98,132，以增强其生物稳定性，延长体内半衰期，降低免疫原性。 方法：采用PCR法构建了用丝氨酸取代rhFGF-1的第98，132位半胱氨酸的突变体rhFGF-1ser98,132，然后用20kDPEG-马来酸酰亚胺对rhFGF-1突变体的第31位半胱氨酸残基进行定点化学修饰。 结果：通过对修饰过程优化，蛋白修饰产率能够达到51.8%。与非修饰型rhFGF-1相比，经PEG修饰的rhFGF-1仍保留着约52.5%的有丝分裂原活性和相似的二级结构。此外，其热稳定性和抗酶解稳定性显著提高。 结论：经过PEG定点化学修饰，rhFGF-1的热稳定性和抗酶解稳定性显著提高。 关键词：聚乙二醇修饰 成纤维细胞生长因子 化学修饰 稳定性
获奖情况
- 1. 英文文章已投稿于《Singapore 2009 International Conference on biotechnology and Nalotechnology 》，目前已收到邀请函； 2．论文《PEG-hFGF-1对SD大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用》已投稿于《中国生物工程杂志》； 3．已申请发明专利一项：《成纤维细胞生长因子-1及其突变体的聚乙二醇修饰产物》，受理号：200910099031.6； 4.浙江省第十一届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛特等奖。
鉴定结果
参考文献
- 1.J Invest Dermatol.104,850-5. 2.Surgery.120,182-188. 3.Biochem Biophys Res Commun.171,1387-94. 4.J Biol Chem.266,5842-6. 5.Proc Natl Acad Sci USA.84,1487-91. 6.J.Biol.Chem.269,7610-6. 7.Growth Factors.3,287-98.
同类课题研究水平概述
- 蛋白质化学修饰技术是近年来快速发展的新兴技术。蛋白质的化学修饰是指通过以某些物质如PEG、葡聚糖、肝素等作为化学修饰剂与蛋白质的活性基团发生反应，从而达到改善蛋白质性质，如解除异体蛋白质免疫原性、毒副作用以及增加活性、提高稳定性、延长体内半衰期的目的。 在蛋白质的化学修饰中，修饰剂的选择非常重要。一般条件下，要求修饰剂具有较大的分子量，良好的生物相容性及水溶性，修饰剂分子表面有较多的反应活性基团等，归因于PEG类修饰剂的卓越特性，目前应用最为广泛。化学修饰的另一个关键点即选择合适的修饰位点，以前对于蛋白质或肽类分子，常常参与反应的修饰基团为α-氨基和ε-氨基，但针对该类基团的化学修饰，随机性和偶然性比较大，对分离制备带来了很大的困难，目前针对特异位点的定点修饰成为研究热点，其中主流的方法有：① 通过定点突变的方法，引入游离的半胱氨酸残基，采用合适的修饰剂对该突变体实现定点修饰；② 通过设计特定的化学修饰制剂与蛋白质中特定的糖类残基或-0H发生特异性的偶联反应，实现定点修饰。 到目前为止，国内外PEG修饰技术已经被应用于近100种不同酶类、蛋白、多肽和其它化合物。PEG修饰蛋白质药物己广泛应用于临床。但在这方面，国外由于起步较早，已经远远领先于我国，到目前为止，国外已有超过10种PEG修饰蛋白上市，如：干扰素α-2b、干扰素α-2α、粒细胞集落刺激因子、生长抑制素、水凝胶和天冬酰胺酶等，并且最近五年平均每年都有一个该类新药上市；我们国家虽然有部分科研院和高校如中国药科大学、天津大学、中国科学院、上海生化所开展相关的研究，但相比国外而言，起步晚，而且仅限于实验室阶段，差距非常明显，这无疑对我们提出了非常严峻的考验。 本课题为实现对成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）的定点化学修饰，创造性地采用基因工程方法获得了FGF-1突变体FGF-1ser98,132并采用PEG-马来酰亚胺实现了对FGF-1的定点化学修饰，在国内外均属独创性研究。本研究通过正交试验获得了FGF-1的最佳修饰条件，在最佳修饰条件下，修饰产率达到51.8%，显著高于国内有关其他蛋白如IFN、GSF的化学修饰的报道；同时修饰产物在很好地保留蛋白活性的基础上，表现出良好的热稳定性和抵抗胰蛋白酶降解的能力，该研究与国内外研究相比具有较强的创新性，并具有广阔的临床应用前景。
