基本信息
- 项目名称：
- Survivin剪接体的细胞定位、相互作用及在细胞凋亡中的作用研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究通过荧光标记确定了survivin-ΔEx3和survivin-2B的细胞定位，通过流式分析确证了两者对细胞周期的影响，同时还首次利用荧光共振能量转移（FRET）技术对两者的相互作用进行了研究，实时直观地从分子水平揭示了两者的相互作用，此还还对sur-2B在凋亡过程中与线粒体的相关性进行了研究。为进一步研究两者在肿瘤细胞发生发展中的作用奠定了基础。
- 详细介绍：
- 手术治疗、放射治疗和化学药物治疗是恶性肿瘤治疗的传统手段，随着现代生物技术的发展，生物治疗日趋重要，而寻找有效的肿瘤治疗靶点对于生物治疗非常重要。 Survivin作为凋亡抑制蛋白家族的新成员在细胞凋亡和细胞周期的基因调控中发挥重要作用，它在大部分的肿瘤细胞中都有表达，但是在大部分的正常组织中表达缺失或很低，因此是重要的肿瘤相关抗原。它至少有3种剪接体产物：survivin-2B，survivin和survivin-ΔEx3，这三个剪接体虽然来自同一个基因，但是功能却有很大区别， survivin和survivin-ΔEx3具有抑制凋亡的作用， survivin-2B则具有促进细胞凋亡、抑制细胞有丝分裂的作用。 目前，对于它们在细胞凋亡中的角色以及相互之间是否存在调节作用等问题研究的还不是很清楚。考虑到survivin-ΔEx3和survivin-2B功能的相互拮抗，本研究首先利用荧光标记确定了它们在细胞内的定位，然后利用荧光共振能量转移（FRET）分析他们是否存在直接的相互作用以及作用的强弱，利用流式分析两个剪接体对细胞周期的影响，同时通过对线粒体的染色观察survivin-2B在细胞凋亡过程中与线粒体变化的相关性。通过这些研究希望为进一步了解Survivin不同剪接体在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。 本研究受国家生物医药类专业创新人才培养试验区建设点的资助
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 肿瘤相关抗原Survivin至少有3种剪接体产物： survivin，ΔEx3和2B，这三者的功能有很大的区别，前两个具有抑制凋亡的作用，2B具有促凋亡的作用。目前对于它们之间的作用机理还不很清楚。本研究拟利用荧光标记确定ΔEx3和2B的细胞定位，利用FRET分析他们的相互作用，利用流式分析它们对细胞周期的影响，同时观察2B在凋亡过程中与线粒体的相关性。为了解其在肿瘤发生中的作用奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- sur-ΔEx3具有抗凋亡功能，sur-2B则有促进细胞凋亡的作用。本研究通过荧光标记确定了两者的细胞定位，通过流式分析确证了两者对细胞周期的影响，同时还首次利用荧光共振能量转移（FRET）技术对两者的相互作用进行了研究，实时直观地从分子水平揭示了两者的相互作用，此外还研究了凋亡过程中sur-2B与线粒体的相关性。这些结果为进一步研究sur-2B和sur-ΔEx3在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。
应用价值和现实意义
- 肿瘤的生物治疗越来越为研究者所关注，但是目前仍然缺乏有效的治疗靶点。本文的价值和意义在于，通过研究survivin不同剪接体的相互作用情况及对肿瘤细胞生长与凋亡的调控机制，使我们逐步了解这一重要的肿瘤相关基因的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用，以期为肿瘤的生物治疗或者药物开发提供新的靶点和思路。
学术论文摘要
- 目的：研究Sur-2B和Sur-ΔEx3的相互作用以及对细胞周期的影响，探讨suivivin各剪接体的生物学功能及在肿瘤发生发展中的作用。方法:利用青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）分别标记Sur-2B和Sur-ΔEx3，通过激光共聚焦显微镜观察它们的细胞定位；通过荧光共振能量转移（FRET）研究两者在细胞内的相互作用情况；利用流式细胞仪分析两者对肿瘤细胞周期的影响；通过细胞染色观察Sur-2B与线粒体在凋亡过程中的相关性。结果：荧光蛋白示踪表明Sur-2B主要分布在胞质中，Sur-ΔEx3主要分布在核内少量分布在胞质中；RT-PCR结果表明Sur-ΔEx3能够显著抑制Sur-2B的表达，FRET分析表明两者在细胞质中存在着很弱的相互作用，暗示两者之间可能是一种间接的作用方式；流式分析表明Sur-2B能够明显促进细胞的凋亡，在细胞凋亡过程中Sur-2B没有变现出明显的线粒体定位，而是聚集在凋亡起始的部位。结论: Sur-2B和sur-ΔEx3在细胞内具有明显的分布差异，两者可能是通过间接的方式相互作用；Sur-2B在凋亡的早期即发生聚集，但没有表现出与线粒体有明显的相关性。
获奖情况
- 1、前期部分内容发表于《中国免疫学杂志》2007年第23卷11期上，并获评优秀学术会议论文。 2、拟投稿“A study on interaction between Survivin-2B and Survivin-ΔEx3 by FRET”
鉴定结果
- 2B位于胞质，ΔEx3主要位于核内少量位于胞质；FRET分析表明两者在胞质中存在很弱的相互作用；流式分析表明2B能够明显促进细胞凋亡，在凋亡过程中2B聚集在凋亡起始部位，没有表现出明显的线粒体相关性。
参考文献
- Altieri DC. Nat Rev Cancer, 2003, 3(1): 46-54. Wu YK, Chen KT, Kuo YB, et al. Cancer Lett, 2009, 273(2):331-335. Engels K, Knauer SK, Metzler D, et al. J Pathol, 2007, 211(5):532-540. Ambrosini G, Adida C, Altieri Dc. Nat Med, 1997, 3 (8): 917-921. Mahotka C，Wenzel M，Springer E，et al. Cancer Res, 1999, 59(24): 6097-6102. Ling X, Cheng Q, Black JD, et al. J Biol Chem, 2007, 282(37):27204-27214. Jensen-Smith H, Currall B, Rossino D, et al. Methods Mol Biol, 2009, 493:369-379. Sun C, Nettesheim D, Liu Z, et al. Biochemistry, 2005, 44(1): 11-17. Blum R, Jacob-Hirsch J, Rechavi G, et al. Mol Cancer Ther, 2006, 5(9): 2337- 2347. Yonesaka K, Tamura K, Kurata T, et al. Int J Cancer, 2006, 118 (4):812-820.
同类课题研究水平概述
- 国内外研究证实, Survivin 能直接抑制凋亡信号通路的下游效应蛋白Caspases3, 7 的活性并能抑制Fas、Bax 和抗癌药物所诱导的凋亡,此外,survivin 还特异地在细胞周期G2/M期高表达, 通过与细胞有丝分裂纺缍体的微管结合, 参与细胞增殖。Survivin通过与半胱天冬酶（ Caspase）特异性结合，主要抑制Caspase3 和Caspase7 的活性，而阻断细胞凋亡过程。Survivin 仅在少数正常成人组织中有一定表达，而在人类多种常见肿瘤中存在高表达,并且与肿瘤的形成和发展密切相关。 Mahotka 等首先在人类肾癌细胞株中发现Survivin 存在2 个剪接变异体，即Survivin-ΔEx3和Survivin-2B。Survivin-ΔEx3含137个氨基酸,来自外显子1、2 和4 ,是外显子3 缺失导致读码框架突变产生的变异体，缺失了118bp 的第3 外显子，而Survivin-2B插入了69bp的第2内含子；前者保留了与Survivin相似的抗细胞凋亡活性，而后者的抗细胞凋亡活性明显减弱。TakashimaH等的研究表明，HCC中survivin-ΔEx3和survivin表达与高增殖活性相关，而survivin-2B以显性负性的方式下调survivin的功能。survivin-ΔEx3具有强抗凋亡功能，survivin-2B丧失了抗凋亡功能。 Krieg 等发现,在各期胃癌中,survivin 和survivin-ΔEx3 表达水平未变,但survivin-2B 的表达水平随着分期的升高而增加( P= 0. 033)。Vegran等指出,在乳腺癌发生、发展及治疗的不同阶段,survivin 各剪接异构体的表达具有差异性。 就目前的研究进展来看，对于Survivin-2B和Survivin-ΔEx3的作用途径与其详细机制还不是十分清楚，有待进一步的研究和探索。
