基本信息
- 项目名称：
- 截短的猪戊型肝炎病毒ORF2基因克隆与重组蛋白的原核表达
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 用巢式PCR从阳性猪戊型肝炎粪便悬液中克隆了截短的猪戊型肝炎病毒ORF2基因（SORF2）片段，并将克隆基因亚克隆到原核表达载体pTO-T7上构建表达质粒pTO-T7-SORF2,然后转化大肠杆菌，SDS-PAGE检测发现在大肠杆菌中以包涵体形式获得了高效表达，Western-blot证明表达蛋白具有良好的特异性和反应原性，包涵体纯化时发现该重组蛋白在4 mmol/L 的尿素-Tris溶液 (pH 7.2) 中的溶解度较大，有利于重组蛋白的复性，为今后开发家畜用诊断试剂预防猪戊型肝炎的流行与人畜交叉感染奠定了一定的基础.
- 详细介绍：
- 从本地不同的养猪场收集猪新鲜粪便，用商品化的人用诊断试剂盒检测，从HEV阳性的猪粪便中提取的 HEV RNA 为模板，经过反转录和巢式PCR扩增后，扩增产物进行1.5％ 琼脂糖凝胶电泳，从胶上可以看到一条清晰特异的DNA带，扩增片段大小和预期扩增的730bp 接近，经连接载体测序得到其为基因Ⅳ型。 用 NdeⅠ/EcoRⅠ将测序正确的 pMD18-T-SORF2 进行酶切，然后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收约730 bp大小的片段，然后用 T4DNA 连接酶将回收片段连接到用 NdeI/EcoRI 酶切处理的 pTO-T7 表达载体上，转化大肠杆菌后用卡那霉素筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒进行酶切鉴定，结果发现，在阳性质粒中大部分已经连入了 SORF2，酶切片段的大小和克隆的 SORF2 大小一致，说明已经成功构建了插入 SORF2的pTO-T7 重组表达质粒，命名为 pTO-T7- SORF2。 酶切验证的重组表达质粒转化大肠杆菌，卡那霉素筛选阳性克隆，当转化子长到针尖大小时挑取单菌落，并诱导表达外源蛋白质。诱导完成处理菌体后，进行12%的 SDS-PAGE，诱导了的重组菌株比没有诱导的重组菌株在27KD 左右明显多出了一条蛋白带，而且其分子量与SORF2蛋白大小相符，而没有诱导的重组菌株没有这条带的出现，说明重组蛋白在大肠杆菌中获得了表达。凝胶成像系统分析，重组蛋白的表达量达到总蛋白的38%左右. 然后采用本研究室制备的单克隆抗体对大肠杆菌表达的重组蛋白 Western blot 检测，结果表明，表达的重组蛋白具有良好的特异性和反应原性，没有诱导的重组菌株没有检测出对应的活性条带. 因此表达的重组蛋白具有作为免疫诊断抗原的潜在可能性. 重组蛋白大量表达后，收集菌体，采用超声波裂解，分别收集上清和沉淀，进行 12% 的 SDS-PAGE，结果发现重组蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中，将收集的包涵体进行洗涤纯化，在 4 mol/L 的 Urea-Tris 中溶解度比较大，有利于重组蛋白的复性和蛋白的回收率。 在禽流感和猪流感在全球的爆发的今天，对人畜共患病的研究也越来越受到各国政府的重视.因此，本研究中我们从猪粪便中克隆了猪HEV ORF2序列，大肠杆菌中表达出了具有良好生物活性的重组猪HEV ORF2片断蛋白，为开展诊断试剂与重组疫苗的研究打下了基础. 文章发表在中国科技论文统计源核心期刊，中国科技核心期刊《激光生物学报》2009年第18卷第3期上.
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 撰写目的：本人在实验室克隆出了截短的猪戊肝病毒ORF2基因，构建了重组表达菌株，诱导表达蛋白,相关实验证明该蛋白具有特异性和反应原性，为开发家畜用诊断试剂和疫苗预防猪戊肝的流行与人畜感染奠定了基础. 基本思路：1、SHEV RNA提取；2、SHEV ORF2 基因克隆；3、表达载体构建；4、重组蛋白小量鉴定；5、重组蛋白表达水平与生物活性检测；6、工程菌表达；7、包涵体洗涤纯化。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：戊肝是危害人类健康的一种疾病，病原体能跨种间传播，本实验原核表达的ORF2是该病毒的中和表位基因，得到的重组蛋白为以后研究其感染途径及诊断试剂盒和疫苗奠定了基础。 先进性：运用经典的分子生物学和基因工程的手段。 独特之处：目前针对畜用ORF2蛋白研究较少，本人用巢式PCR从阳性的猪戊肝的粪便中扩增出了该基因；利用大肠杆菌表达得到了重组的具有特异性和反应原性的蛋白。
应用价值和现实意义
- 作品的实际应用价值：得到的中和表位蛋白，可以用以研究病毒的感染、研究病毒传播途径；研发诊断试剂和畜用疫苗。 现实意义：为进一步研究该蛋白的特性和利用该蛋白解决其他问题奠定了坚实基础；该蛋白具有反应特异性和反应原性。这为以后开发廉价的畜用诊断试剂和疫苗提供了一个研究方向，也为尽早阻断动物HEV在动物间和人畜间的交叉传播和预测HE的流行做出了一定的基础性贡献。
学术论文摘要
- 用巢式PCR从阳性猪戊型肝炎粪便悬液中克隆了截短的猪戊型肝炎病毒ORF2基因（SORF2）片段，并将克隆基因亚克隆到原核表达载体pTO-T7上构建表达质粒pTO-T7-SORF2,然后转化大肠杆菌，SDS-PAGE检测发现在大肠杆菌中以包涵体形式获得了高效表达，Western-blot证明表达蛋白具有良好的特异性和反应原性，包涵体纯化时发现该重组蛋白在4 mmol/L 的尿素-Tris溶液 (pH 7.2) 中的溶解度较大，有利于重组蛋白的复性，为今后开发家畜用诊断试剂预防猪戊型肝炎的流行与人畜交叉感染奠定了一定的基础.
获奖情况
- 文章发表在中国科技论文统计源核心期刊，中国科技核心期刊《激光生物学报》2009年第18卷第3期上
鉴定结果
- 本作品经刘如石副教授鉴定系本文作者在导师指导下独自完成，以上所填各项内容均真实可信、符合自然科学研究要求，特此鉴定。
参考文献
- 参考文献（部分）： [1]王佑春 中国戊型肝炎病毒4型的流行病学、分子生物学和家畜感染研究[J]. 中华流行病学杂志, 2003 , 24 (7) :618～6221 [2]刘如石，何志强，李少伟，杨坤宇，鲜阳凌，逄淑强，张军，李益民，夏宁邵. 重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养. 生物工程学报, 2004，03：450-455. (8) :1669～1674 [3]何志强，张军，李少伟，林鉴，刘如石，陈毅歆，王颖彬，夏宁邵. 颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋及其抗原性与免疫原性. 生物工程学报, 2004,0:263-268. [4] WONG D C, PURCELL R H, SREENIVASAN M A, et al. Epidemic and endemic hepatitis in India: evidence for non-A, non-B hepatitis virus aetiology. Lancet,1980;2: 876-879 [5] DAS K.,AGARWAL A., ANDREW R., et al. Role of hepatitis E and other hepatotropic virus in aetiology of sporadic acute viral hepatitis : a hospital based study from urban Delhi. Eur J Epidemiol ,2000,16(10) :937～940 [6] TAM A W, SMITH M M, GUERRA M E, et al. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology, 1991; 185: 120–131. [7] KABRANE-LAZIZI Y, MENG X J, PURCELL R H, et al. Evidence that the genomic RNA of hepatitis E Virus is capped. J Virol, 1999; 73: 8848–8850.
同类课题研究水平概述
- 戊肝是由戊肝病毒引起的粪口传播的疾病，主要流行于发展中国家，常因饮用水源被污染导致暴发流行，散发病例呈全球分布，临床上超过50 %的急性肝炎为HEV 所致，感染孕妇病死率高达20 %.我国是戊肝的高流行区之一，自1982发现戊肝病例以来至，今已报道了11次戊肝流行, 最大的一次爆发流行于1986年9月至1988年4月发生在新疆南部的和田、喀什和克孜勒苏三地州，波及23个县市，持续20多个月，共发病119280例，死亡近千人，孕妇平均死亡率为13.5%. 对人民的生命健康造成了严重危害，并引起了社会广泛关注. 其基因为单股正链RNA，全长约7.2～7.5kb，全基因组编码3个互相重叠开放读码框（ORFs），其中ORF2编码660 aa的病毒衣壳蛋白，其上有重要的中和表位，可能与细胞受体结合，是疫苗和诊断试剂的重要组成部分. 更为主要的是，Balayon、Meng和我国病毒学家夏宁邵、王佑春等评估了家畜HEV与人HEV的交叉感染，证明HEV为人畜共患病. 接着Huang等和我国病毒学家王佑春、毕胜利、田克恭等发现各型间基因与氨基酸同源性很高，为HEV为人畜共患病提供了分子证据. HEV在动物和人之间的交叉感染引起了一个重要的全球性的公共卫生问题——高风险人群(兽医、肉加工者、养殖户等)能感染人畜共患性HEV，因此，HE作为一种人畜共患病也受到了应有的重视.人用诊断试剂和疫苗取得了较大的进展，我国病毒学家夏宁邵、毕胜利等研究过人HEV ORF2的重组表达作为疫苗的研究，获得了一些具有优良免疫源性和抗原性的重组蛋白.夏宁邵教授在大肠杆菌中表达了人HEV ORF2 aa368～606 片段,获得的重组蛋白HEV 239可以形成病毒样颗粒，免疫恒河猴可产生良好的保护性.但是到目前为止，家畜用诊断试剂和疫苗没有取得突破性进展，而是人用疫苗和诊断试剂成本高，如果用于家畜，会增加肉与肉制品的价格，进而影响人们的生活水平. 因此研究有效的家畜专用诊断试剂和预防性疫苗来阻止家畜HEV向易感人群的传播，越来越收到人们的重视. 尤其是禽流感和猪流感在全球的爆发，对人畜共患病的研究也越来越受到各国政府的重视.因此，本研究中我们从猪粪便中克隆了猪HEV ORF2序列，大肠杆菌中表达出了具有良好生物活性的重组猪HEV ORF2片断蛋白，为开展诊断试剂与重组疫苗的研究打下了基础.
