基本信息
- 项目名称：
- 利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 疾病的产生大多是由于膜受体蛋白发生异常所引起的，抗体检测疾病是目前医学上常用的检测方法。 免疫血清学诊断方法具有多指标、大样本和高度自动化等众多优点，但是各种检测方法的基本原理仍然依赖于抗原抗体间的特异性结合，建立一种能够持续产生具有一定特异性的抗体制备方法是发展免疫学检测技术的基本条件之一，产生的抗体可以检测膜上受体的含量，从而为疾病的检测提供一定的依据。 本项目采用基因重组的方式，通过载体与目的基因融合，表达出具有GST标签的多肽，进而免疫产生具有高效价和特异性的多克隆抗体，从核苷酸层面上进行膜受体抗体的制备。
- 详细介绍：
- 受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，通常位于细胞膜上，主要为膜蛋白，可以识别有生物活性的化学信号物质（配体），并与其发生特异性结合，从而激活或启动一系列生物化学反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。疾病的产生大多是由于膜受体蛋白发生异常所引起的，抗体检测疾病是目前医学上常用的检测方法。 免疫血清学诊断方法具有多指标、大样本和高度自动化等众多优点，但是各种检测方法的基本原理仍然依赖于抗原抗体间的特异性结合，建立一种能够持续产生具有一定特异性的抗体制备方法是发展免疫学检测技术的基本条件之一，产生的抗体可以检测膜上受体的含量，从而为疾病的检测提供一定的依据。 全长的膜蛋白很难进行基因工程方法获得，虽然其表面抗原决定簇可以通过基因克隆的方法获得，不过短肽的免疫原性较低，甚至没有免疫原性，本项目采用基因重组的方式，通过载体与目的基因融合，表达出具有GST标签的多肽，进而免疫产生具有高效价和特异性的多克隆抗体，从核苷酸层面上进行膜受体抗体的制备。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 全长的膜蛋白很难进行基因工程方法获得，虽然其表面抗原决定簇可以通过基因克隆的方法获得，不过短肽的免疫原性较低，甚至没有免疫原性，但用GST融合多肽能够使其具有免疫原性，可免疫动物产生相应抗体，同时解决了膜蛋白抗体制备困难的问题，此多克隆抗体可以检测膜上受体的含量，从而为疾病的检测提供一种新的方法。
科学性、先进性及独特之处
- 抗体检测疾病是目前医学上常用的检测方法，单抗检测费用昂贵，多抗检测成本低，传统的多抗制备方法分为全蛋白免疫和载体蛋白与多肽耦合，但其产生的抗体多且杂、不易纯化、费用昂贵、操作具有一定危险性。膜受体的表达具有一定困难性，其抗体也不易制备，本项目采用基因重组的方式，通过载体与目的基因融合，表达出具有GST标签的多肽，进而免疫产生具有高效价和特异性的多克隆抗体，从核苷酸层面上进行膜受体抗体的制备。
应用价值和现实意义
- 一代代多抗检测试剂盒的推出，为病人带来了新的生命之光。多抗还可以用于基因功能研究、蛋白细胞定位、RNAi 干扰、miRNA 功能研究、反向蛋白质组学等。市场上常用的单抗检测试剂盒售价昂贵，为多抗检测试剂盒的10倍左右，而现有的多抗检测试剂盒售价一般为＄229/200μL，价格同样较昂贵，本项目所制备的高特异性多抗将主要应用于检测膜蛋白，为疾病的检测提供一定依据，且所需成本较低，具有较高性价比。
学术论文摘要
- 受体是细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，通常位于细胞膜上，主要为膜蛋白，可以识别配体，并与其发生特异性结合，从而引发一系列生物效应。我们首先选取与疾病相关的膜受体蛋白作为研究对象，将其氨基酸残基序列用BJTEpitope软件预测抗原决定簇，选取这些抗原决定簇中亲水性最强的构建融合多肽，人工合成编码该决定簇TnCAb的DNA片段，该片段长为51 bp，编码16个氨基酸残基，预测分子量为4 kD。接着将该片段克隆到表达载体pGEX-4T-3的相应酶切位点，得到了融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3-TnCAb，经PCR及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21-star，用终浓度为1 mM的IPTG诱导重组菌，收集菌体裂解后进行SDS-PAGE分析，在30 kD左右的位置有一特异性蛋白条带，与预期值相符，融合蛋白以可溶的形式存在，故用超声裂解菌体后12000 rpm离心所得的上清以亲和层析的方法纯化目的蛋白GST-tag TnCAb。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔，制备了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗血清效价，Western blot检测抗体特异性。
获奖情况
- 获2008年省级相关学术机构项目资助 论文“抗体制备技术在医药领域的应用”已录用在“药物生物技术”杂志上 论文“甲型H1N1流感的流行现状及处理对策的思考”已录用在“药物生物技术”杂志上 论文“利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究”已录用在××大学学报上
鉴定结果
- 我们成功地完成了多肽的GST融合表达并利用GST融合多肽制备了多克隆抗体，该多抗与免疫原具有一定的特异性，可以进一步研究各种膜蛋白抗原表位多肽的抗体制备及其抗体效价、特异性的分析。
参考文献
- [1] 冯仁青, 郭振泉等. 现代抗体技术及其应用. 北京: 北京大学出版社, 2006.1: 1-5 [2] 卢圣栋. 生物技术与疾病诊断——兼论人类基因治疗. 北京: 化学工业出版社, 2002.2: 1-28 [3] 邓筠, 沈南, 王元. Toll样受体7在抗感染与自身免疫疾病中的作用. 医学分子生物学杂志, 2008, 5 (1) : 69-72 [4] WANG J, SHAO Y,BENNETT TA, et al. The functional effects of physical interactions among Toll2like receptors 7, 8, and9 [ J ] 1 J Biol Chem, 2006, 281 (49) : 374272374341 [5] Veronica Morea, Arthur M. Lesk and Anna Tramontano,. Antibody Modeling: Implications for Engineering and Design. Methods, Volume 20, Issue 3, March 2000: 267-279 [6] 徐铮奎. 前景广阔的抗体类药物. 中国制药信息, 2002, 18（12）：16-17 [7] 《新一代生物技术药物国际论坛-单克隆抗体及疫苗类药物研发及产业化面对的挑战》会刊, 中国生物工程学会, 2002 年10月14日, 中国, 北京 [8] Janice M. Reichert. Trends in the development of therapeutic anti-cytokine antibodies. Drug Discovery Today, Volume 9, Issue 8, 15 April 2004: 348 [9] Pharmacokinetic and pharmacodynamic. properties of EGFR inhibitors under clinical investigation. Cancer Treatment Reviews, Volume 30, Issue 3, May 2004: 255-268
同类课题研究水平概述
- 免疫血清学诊断方法也由单纯的免疫凝集、免疫沉淀、免疫扩散技术发展为结合不同标记物（如放射性同位素、荧光物质、酶和化学发光物质等）的免疫标记技术，检测过程和数据读取也逐步向半自动化和自动化过渡。 常用的多克隆抗体制备的方法有两种：全蛋白免疫产抗体和蛋白与多肽耦合免疫产抗体。全蛋白法免疫产生的抗体多且杂，不易纯化，检测效果不佳，蛋白与多肽耦合刺激产抗体法为生物公司常用方法，但所需试剂价格昂贵且具一定危险性，如制备时所需的试剂戊二醛有很大毒性，目前常用的载体蛋白为BSA或血蓝蛋白。 全长的膜蛋白很难进行基因工程方法获得，短肽免疫原性低，甚至不具有免疫原性。本项目致力于研究一种人源膜受体多抗的制备方法，通过载体与目的基因重组，表达出具有GST标签的多肽，进而免疫产生具有高效价和特异性的多克隆抗体，从核苷酸层面上进行抗体的制备，产生的抗体可以检测膜上受体的含量，从而为疾病的检测提供一种新的方法。 近年来，Immunosystems Inc.已生产出了几种ELISA试剂盒，其靶分析物包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂。这种试剂盒配上便携式分光光度计可实现野外定量快速测定，检测灵敏度为0.03～25 ppb。随着ELISA在农药监测中的应用范围的不断扩大，一些新方法也不断涌现。Hall等用EIA法检测了水样中的污染物2,4-D,三嗪，Merolachlor并将其与气相色谱分析结果进行比较。Roda 等利用EIA对环境水样中苯并芘进行了测定。Hong利用ELISA对土壤和水中三氮杂苯类除草剂行了测定。Hutchinson等利用ELISA检测土壤中的EPTC。Wittmann用酶免疫分析法检测残留在食品中的三嗪。Weller通过改变温育时间，提高了ELISA检测三氮杂苯类除草剂的灵敏度。我国的研究者也自行开发了一些ELISA法。刘长武应用ELISA对梨、苹果中的对硫磷残留进行了测定。余万俊制备了杀虫脒的特异性抗体，并以此抗体建立了大米中杀虫脒残留的单克隆抗体ELISA检测法。阳传和应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研究出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立了小麦T-2毒素的ELISA方法。周永新等进行了蓖麻毒素多克隆抗体的研究。
