基本信息
- 项目名称：
- 重茬地黄自毒物质和病原微生物的分离鉴定
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科多年生草本植物，以干燥块根入药，是我国著名的“四大怀药”之一(丁自勉，2001)。地黄是连作障碍最严重的植物，种植后须间隔8～10年才能再次种植(郭巧生, 2004)。地黄连作障碍发生时没有明显的病害现象，地黄连作障碍特征非常明显，主要表现为块根不膨大，几乎全为须根，病害严重，可导致减产80%左右。植物通过分泌、淋溶等途径产生的自毒物质影响植株代谢产生自毒作用和病菌引起的病害是地黄连作障碍的主要原因，本研究分离鉴定了地黄的化感自毒物质黄酮A和病原菌尖孢镰刀菌。
- 详细介绍：
- 地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科多年生草本植物，以干燥块根入药，是我国著名的“四大怀药”之一(丁自勉，2001)。现代药理研究证明，地黄具有降血糖、保肝、止血、利尿、抗炎、抗真菌等作用。此外，地黄中的多糖RPS-b是具有增强免疫力与抑制肿瘤活性的有效成分(郭巧生,2004)。怀地黄为我国传统的大宗道地中药材，一直被视为药材中的上品(丁自勉，2001)，它自明代后，因主产于古“怀庆府”（今河南焦作）一带而得名(王太霞,2005)，2007-2008年份在河南省焦作地区种植面积已达20万亩，年总产值在数十亿元。 连作障碍指在同一块土壤连续栽培同种或同科的作物时，即使在正常的栽培管理措施下，也会发生长势变弱、产量和品质下降的现象(吴凤芝等，2000)。 地黄是连作障碍最严重的植物，种植后须间隔8～10年才能再次种植(郭巧生, 2004)。地黄连作障碍发生时没有明显的病害现象，地黄连作障碍特征非常明显，主要表现为块根不膨大，几乎全为须根，病害严重，可导致减产80%左右，从经济效益角度考虑，发生连作障碍的地黄块根过小，已经没有经济价值。受市场需求及经济利益驱动，药农不得不在焦作以外地区种植。但由于土壤，田间小气候等环境条件与道地产区不同，它们虽然还被称为怀地黄，但其主要有效成分的含量会发生改变。如，为主要有效成分之一的梓醇会因地黄种植地域不同，其含量有较大差异（刘长河等,2001），严重影响了怀地黄的产量和质量，地黄的药效也大打折扣。所以地黄连作障碍研究成为规范化生产地黄迫切需要解决的问题。 化感作用是指“植物（包括微生物）之间相互抑制或促进的生物化学作用”（Rice,1984）。植物化感作用的本质是植物通过向体外释放化学物质而影响邻近植物，其释放的化学物质称为化感物质，当供体与受体属于同一植物种时，就称其为自毒作用，又称自身化感作用或自体中毒。自毒作用往往是植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径来释放一些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用，它是化感作用的重要形式之一(Singh等，1999)，具自毒作用的化感物质称为自毒物质。自毒物质影响植株代谢产生自毒作用在连作障碍成因上具有十分重要的作用，是植物连作障碍的主要因子之一（张晓玲，2007）。 同一种作物长期连作，作物与微生物相互选择的结果造成了土壤微生物区系变化，有益微生物减少和某些病原菌数量的增加，从而影响植物的正常生长和生命活动，病原微生物数量增加(Chang和Juma,1996; Baca等,2003)也是作物发生连作障碍的主要原因。 从地黄化感自毒物质的角度考虑需要做的试验工作是：对地黄组织进行水浸提，对浸提液进行萃取分成不同组分并生物测定跟踪自毒物质的去向，然后进一步对含有自毒成分的有机相或水相进行柱层析，柱层析分离后进行生物测定验证自毒效果，具有自毒作用的组分再进行通过GC-MS或HPLC-MS以及红外光谱、核磁共振鉴定。 从病原微生物的角度需要做的工作是：采用组织分离的方法分离造成地黄根腐烂引起“死棵”的病原菌。 本研究最终分离鉴定了地黄的自毒物质为黄酮A，病原微生物为尖孢镰刀菌。
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撰写目的和基本思路
- 目的：本研究的目的是分离鉴定出造成地黄连作障碍的自毒物质；分离鉴定出造成重茬地黄严重病害的病原菌。 基本思路：对地黄组织进行水浸提，对浸提液进行萃取分成不同组分，含有自毒成分的有机相再进行柱层析分离，整个分离过程通过生物测定跟踪，具有自毒作用的组分再进行GC-MS、核磁共振等技术鉴定。病原菌的分离则采取组织分离再回接至地黄苗进行病原菌致病性测定的方法进行。
科学性、先进性及独特之处
- 很多植物的自毒作用已有研究报道，如大豆、苜蓿等。本试验采用浸提、萃取、硅胶柱层析分离、制备液相分部收集、红外技术鉴定了地黄的自毒物质黄酮A，利用组织分离技术分离鉴定了地黄的病原菌尖孢镰刀菌，本研究采用的这些方法技术是成熟的、科学的，也获得了较好的实验结果。地黄连作障碍特征非常明显直观：块根不膨大，这是连作障碍研究的好材料，地黄必将成为研究连作障碍理论的模式作物，本研究处于化感作用研究领域的前沿。
应用价值和现实意义
- 地黄有几千年的种植历史，连作障碍问题比较严重，但属于传统中药而被栽培方面的科研所忽视，创新团队另辟奇径，针对地黄开展研究，实践意义大。该创新课题立足于农业生产实际，采取科学的实验方法分离鉴定了地黄的自毒物质和病原菌，试验结果非常好。如果能够开发防治地黄根腐病的杀菌剂及消减黄酮A的菌肥，市场前景及经济效益都非常好。
学术论文摘要
- 地黄为玄参科多年生草本植物，存在着严重的连作障碍现象。本研究对地黄不同组织的浸提液进行生物测定表明地黄块根含有影响种子发芽率及幼苗根长、苗长的自毒物质，地黄块根浸提后萃取相中乙酸乙酯相自毒活性强，乙酯乙酯相旋蒸后通过两次硅胶柱层析及制备液相分离获得自毒活性最强的组分3，利用红外技术鉴定地黄化感自毒物质为黄酮A。利用组织分离法分离鉴定重茬地黄根腐病病原菌为尖孢镰刀菌。本研究为进一步探索地黄化感物质与土壤的相互作用、转化以及消减地黄连作障碍奠定了良好的基础。
获奖情况
- 2009年5月,获第七届“挑战杯”河南省大学生课外学术科技作品竞赛河南省一等奖。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 吴宗伟,王明道,刘新育,陈红歌,贾新成. 重茬地黄土壤酚酸的动态积累及酚酸对地黄生理生化的影响.生态学杂志, 2009,28 (4): 520-524 . 王明道,吴宗伟,原增艳,陈红歌,吴坤,贾新成.外源阿魏酸对水培地黄生理生化影响. 河南农业大学学报,2009,43(1):337-341. 杜家方,尹文佳,张重义,等.不同间隔年限地黄土壤的自毒作用和酚酸类物质含量.生态学杂志，2009,28(3):445-450 朱广军，王明道，吴宗伟，等．地黄根区土壤潜在化感物质的 GC-MS分析[J]．河南科学．2007，25(2).255-257
同类课题研究水平概述
- 化感作用是指“植物（包括微生物）之间相互抑制或促进的生物化学作用”。当供体与受体属于同一植物种时，就称其为自毒作用。具自毒作用的化感物质称为自毒物质。自毒物质影响植株代谢产生自毒作用是植物连作障碍的主要因子之一。很多植物的自毒作用已有研究报道，如大豆、苜蓿、水稻、番茄、甘蔗、豌豆、西瓜等。 对于自毒作用的研究主要化感自毒物质的提取、分离、鉴定，整个提取分离流程通过生物检测进行跟踪。化感物质的分离常采用水或有机溶剂浸提，再经萃取分成不同组分或旋蒸成浸膏后用不同有机相进行萃取，用GC-MS鉴定不同相或用柱层析进一步分离后进行鉴定。鉴定化感物质往往采用质谱（MS）、核磁共振（NMR）等来鉴定。侯永侠等（2007）用XAD-4树脂柱吸附收集和气相色谱／质谱(GC／MS)鉴定技术分离鉴定辣椒根系分泌物的化感物质烯酸酯、芳香酸酯等。邓思娟等（2008)用95%乙醇浸提青蒿粉碎物，制成浸膏后硅胶柱层析分离，然后用熔点、红外、质谱鉴定了青蒿的化感物质青蒿酸、青蒿素等。 对地黄连作障碍的研究主要是反相高效液相色谱(HPLC)检测地黄种植后土壤中香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛等化感物质明显升高（吴宗伟，2009），并进一步研究酚酸类化感物质对水培地黄生理生化指标的影响（王明道，2009），杜家方（2009）发现种植地黄后间隔不同年限的土壤对地黄块根膨大有影响，酚酸类化感物质与地黄块根产量呈负相关，因此推测酚酸可能是导致地黄连作障碍的自毒物质，但目前未见田间试验外源添加酸酸的报道。而本研究则从地黄组织块根分离到了影响地黄种子发芽及幼苗生长发育的自毒物质，以生物测定以指导分离鉴定了地黄的自毒物质黄酮A。 三七、人参、西洋参连年大面积单一种植，为病虫害的发生和流行创造了有利条件，特别是根部病害已成为限制三七、人参和西洋参种植业发展的严重障碍。据王朝梁等人（1991年）调查，三七根腐病在文山州各年生三七均可受害，其发病率一般为5-20%，严重的达50%。白容霖报道，1982年人参仅因锈腐病造成减产30%以上。缪作清等人（2006年）证实三七根病大多是以Cylindrocarpon spp.为主的病原物复合侵染所致；西洋参根腐病严重时可引起产量损失达50%～70%，病害引起的连作障碍已成为影响人参属植物产业化发展的重要因素。地黄根腐病病原微生物的分离目前尚未见报道。
