基本信息
- 项目名称：
- 奶牛O157: H7大肠杆菌的快速检测与分子流行病学研究
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染性腹泻是近些年来新发现的危害严重的肠道传染病，以O157: H7血清型大肠杆菌为最主要代表菌株。本研究基于EHEC O157: H7的志贺氏毒素1、志贺氏毒素2、紧密素、肠溶血素四个基因建立了多重PCR快速检测方法。该体系可检出10 CFU细菌，模拟样品可达到2 CFU/g。运用该多重PCR方法配合选择性增菌、分离培养和血清学试验等检测手段，了解O157: H7大肠杆菌在江苏一牛群及其环境中的带菌和流行情况。2008年1-12月间，共采集奶牛粪便及其环境等样品共计2998份，最终获得O157: H7分离株共计90株，分离率为3.0%。其中奶牛粪便样的分离率为3.1%（45/1439）；犊牛粪便样的分离率为4.2%（15/359）；奶牛体表分离率为0.8%（2/240）；饲料分离率为3.8%（9/240）；牧场饮水的分离率为1.3%（3/240）；肥料的分离率为1.3%（3/240）；泥浆的分离率为5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分离率为1.2-6.0%，夏秋季分离率较高，其中6月份的阳性率最高，达到6.0%。同时所获得O157: H7菌株的毒力相关基因的携带表现出一定的多态性。由此提示，可能奶牛是人感染EHEC的来源，也有可能通过接触EHEC感染阳性的奶牛或者环境传播给人。因此控制大肠杆菌EHEC在牛场环境中的存活与扩散，加强奶牛及其产品以及牧场环境中该类细菌的检测，是防止人类发生EHEC感染的重要途径之一。
- 详细介绍：
- 肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染性腹泻是近些年来新发现的危害严重的肠道传染病，以O157: H7血清型大肠杆菌为最主要代表菌株。它除引起人腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发症，病死率高。O157: H7大肠杆菌是动物传染性病原体，在动物中几乎不致病，反刍动物是它们的主要自然宿主。其中牛为O157: H7的主要贮存宿主，它没有任何症状却能排泄这种病原体。在我国，奶牛及其产品中O157: H7感染正在受到日益广泛而密切的关注，其对人的健康已构成了巨大威胁。 本研究基于O157: H7大肠杆菌的志贺毒素1、志贺毒素2、紧密素、肠溶血素四个基因建立了多重PCR快速检测方法，该体系可检出10 CFU细菌，模拟样品可达到2 CFU/g。同国标常规培养法相比，通过实验发现，用PCR技术和免疫磁珠技术相结合的方法检测大肠杆菌O157: H7，利用PCR的快速鉴定技术，将检测阳性的样品通过免疫磁珠法进行分离鉴定。结果，阳性分离率由国标常规方法的1.4%提高到2.4%，说明此方法提高了大肠杆菌O157: H7的阳性分离率，这对于大肠杆菌O157: H7的监测工作有很大帮助。同时由于检测方法的简便易操作和无特殊设备要求，使得本检测方法便于在大型牛场推广实施。 为了解O157: H7大肠杆菌在江苏一牛群及其环境中的带菌和流行情况。2008年1-12月间，共采集奶牛粪便及其环境等样品共计2998份，最终获得O157: H7分离株共计90株，分离率为3.0%。其中奶牛粪便样的分离率为3.1%（45/1439）；犊牛粪便样的分离率为4.2%（15/359）；奶牛体表分离率为0.8%（2/240）；饲料分离率为3.8%（9/240）；牧场饮水的分离率为1.3%（3/240）；肥料的分离率为1.3%（3/240）；泥浆的分离率为5.4%（13/240）。2008年1-12月份的分离率为1.2-6.0%，夏秋季分离率较高，其中6月份的阳性率最高，达到6.0%。选取来自于人源的O157: H7株（9株）以及分离的牛源O157: H7菌株（90株），对它们进行相关毒力基因的检测。除了主要毒力基因stx1、stx2、eaeA、hlyA 外，还包括LEE毒力岛中的其他基因（tir、espA等）以及菌体脂多糖基因（rfbE）、鞭毛基因（fliC）等16个基因。结果表明同一牧场分离的O157: H7血清型的菌株毒力基因不完全相同，主要分为3个型，其中以I型为主，占测试菌株的85.9%（85/99），同时这些分离到的O157: H7菌株携带的毒力相关基因表现出一定的多态性。由此提示，奶牛可能是人感染EHEC的来源，也有可能通过接触EHEC感染阳性的奶牛或者环境传播给人。因此通过加强牛及其饲养环境的卫生管理，实施定时监测和控制EHEC在牛场环境中的存活与扩散，加强奶牛及其产品以及牧场环境中该类细菌的检测，是防止人类发生EHEC感染的重要途径之一。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染，尤其O157: H7大肠杆菌感染是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已成为重要的公共卫生问题。因此建立一种特异、灵敏、快速的O157: H7大肠杆菌检测技术是防控肠出血性大肠杆菌感染的关键。本作品以奶牛及其环境作为研究对象，建立肠出血性大肠杆菌的快速检测技术，对奶牛及其环境样品的检测，并作分子流行病学分析，以期为牛奶制品的食品安全防控提供理论基础。
科学性、先进性及独特之处
- 1、建立了简便、快速、敏感性高的多重PCR体系检测O157:H7大肠杆菌技术，分离率高，节约成本，适合推广与应用； 2、对某牧场分子流行病学调查，发现同一牛群及其环境中EHEC以一种基因型为主，同时表现出一定多样性，为控制EHEC在奶牛中感染提供了依据； 3、发现了EHEC可通过接触EHEC感染阳性的奶牛或环境传播给人类，研究结果对人类防治EHEC具有重要意义。
应用价值和现实意义
- 作品建立多重PCR体系结合免疫磁珠分离检测O157:H7大肠杆菌技术，可提高分离率，节约成本，为临床监测提供了一种简便、快速、敏感的方法。 对江苏一牛群及其环境中O157:H7的分子流行病学研究表明，EHEC可通过接触EHEC感染阳性的奶牛或环境传播给人，这为防控EHEC在奶牛中的感染提供了重要依据。这一检测技术对奶牛肠出血性大肠杆菌感染的综合防治具有重要的现实意义。
学术论文摘要
- 牛为O157:H7的主要贮存宿主，它没有任何症状却能排泄这种病原体。在此情况下，奶牛及其产品中O157:H7感染正受到日益广泛而密切的关注，其对人的健康已构成了巨大威胁。 研究基于O157:H7的志贺毒素1、志贺毒素2、紧密素、肠溶血素四个基因建立了多重PCR快速检测方法，该体系可检出10CFU细菌，模拟样品可达到2CFU/g。同国标法相比，运用该PCR方法配合免疫磁珠分离培养等手段，可减轻工作量，节约成本，提高阳性分离率。 2008年1-12月间在一牛群及其环境中共采集奶牛粪便及其环境等样品共计2998份，最终获得O157:H7分离株共计90株，分离率为3.0%。2008年1-12月份的分离率为1.2-6.0%，夏秋季分离率较高，其中6月份的阳性率最高，达到6.0%。同时所获得O157:H7菌株的毒力相关基因的携带表现出一定的多样性。由此提示，奶牛可能是人感染EHEC的来源，也有可能通过接触EHEC感染阳性的奶牛或者环境传播给人。因此控制EHEC在牛场环境中的存活与扩散，加强奶牛及其产品和牧场环境中该类细菌的检测，是防止人类发生EHEC感染的重要途径。
获奖情况
- 作品于2008年12月参加某大学第五届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛，荣获一等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 陈祥, 崔一晨, 高崧, 等. 肠出血性大肠杆菌传播模式. 中国人兽共患病学报. 2008, 24(6): 574-577 [2] 汪华. 肠出血性大肠杆菌O157:H7流行特征和控制对策研究. 医学研究通讯. 2005, 34(05): 24-25 [3] Chen X, Gao S, Jiao X, et al. Prevalence of serogroups and virulence factors of Eschenchia coli strains isolated from pigs with postweaning diarrhea in eastern China. Vet. Microbiol. 2004, 103: 13-20 [4] Holland JL, Louie L, Simor AE, et al. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11): 4108-4113 [5] Paton AW, Paton JC. Detection and characterization of shiga toxigenic Eschenchia coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2 enterhemorrhagic E. coil hlyA，rfbO1l1 and rfbO157. J. Clin. Microbiol. 1998, 36(2): 598-602 [6] Chapman PA, Siddons CA, Zadik RM, et al. An improved selective medium for isolation of Escherichia coli O157. J. Med. Microbiol. 1991, 35: 107-110
同类课题研究水平概述
- 肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染疾病，以O157：H7为最主要代表菌株。O157：H7除引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发征，病死率高，已引起各国的重视。自Riley（1982年）在美国的一起出血性肠炎暴发中首次分离到一种新型的属于肠出血性大肠杆菌并可产生志贺毒素的O157：H7菌株以来，O157：H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、瑞典、澳大利亚、日本等多个国家和地区引起腹泻暴发和流行，严重影响人类的生命健康。 O157：H7大肠杆菌是动物传染性病原体，在动物中几乎不致病，反刍动物是它们的主要自然宿主。其中牛为O157：H7的主要贮存宿主，它没有任何症状却能排泄这种病原体。我国奶牛中O157：H7感染正在受到日益广泛而密切的关注，其对人们的健康构成了巨大威胁。在实际生产中，动物及其产品不可能免于O157：H7大肠杆菌的污染，微生物学实验证实引起人感染O157：H7大肠杆菌的剂量极低，而目前已有的检测方法如常规细菌分离法、免疫磁珠法、酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验、胶体金免疫层析试纸检测法、全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法、全自动病原菌检测系统筛选法、基因芯片等，这些方法或检出率低、或分离率低、或成本昂贵、或操作复杂，它们在快速易行、低成本与高分离率等方面还不能有效结合。因此需要建立一种简便、快速、敏感性高的鉴别和诊断方法。 在世界范围内，对O157：H7大肠杆菌的分离率研究从0.2%-16.6%不等。同时相关研究还发现O157：H7大肠杆菌在牛群中的流行也有一定的季节性，在温暖气候中粪便排泄物的分离率高的规律。病原体能在被粪便污染的水槽沉淀物中存活甚至生长，这可能也是牛长期携带和感染病原体的来源。EHEC在泥浆中的存留，增加了牛感染EHEC的机率，也成为人感染的一个潜在危险。牧场动物产生的废料和污水，包括肥料和泥浆经常用作生长庄稼或牧草的肥料。这些产品中O157：H7的存留，可能成为EHEC在牛中的初始感染和重复感染的一个重要因素。在我国已有从人的散发病例中分离出O157：H7的报道，然而这些病例的病原和传播途径尚不清楚。从牛及其产品中分离出O157：H7大肠杆菌已有报道，但在奶牛群及其环境中，对O157：H7大肠杆菌的跟踪调查和生态学研究较少。
