基本信息
- 项目名称：
- 新型微生物溶栓酶的开发
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 为了获得良好的第三代新型微生物溶栓药物，本实验筛选得到一株高产溶栓酶菌株，获得该酶的详细生理生化性质。扩增出豆豉溶栓酶基因并进行了原核表达，利用生物信息学分析该酶的详细信息，并通过体外分子进化技术对酶的编码基因进行进化改造。通过体外对人血相关实验了解该酶的溶血栓效果和毒副作用。
- 详细介绍：
- 在收集的豆豉产品中分离到369株革兰氏阳性芽孢杆菌，对其进行产溶栓酶活性筛选，得到一株高产溶栓酶菌株，对该菌株进行形态、生理、生化鉴定，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。通过分离纯化得到了纯度较高的溶栓酶。 获得该酶的一些生理生化信息，确定该酶作用的最适温度、酶作用的最适pH、酶的热稳定性、酶的pH稳定性、金属离子对酶活性的影响等。 利用PCR方法从该菌株的总DNA中扩增出豆豉溶栓酶成熟肽编码区片段。将DFE的编码基因克隆到表达载体中并转化到大肠杆菌中，从而构建了pET32a-dfe重组质粒。IPTG诱导表达大量蛋白，经亲和纯化得到较纯的重组溶栓酶蛋白。 通过生物信息学分析表明，该酶的基因序列与已发表的酶具有很高的同源性，编码381个氨基酸，具有信号肽，并且具有典型的溶酶保守区域。利用软件、数据库等工具进行序列分析，结果表明该酶的等电点为6.325，分子量为27727.802 Da,是a螺旋，β折叠和无规卷曲共同构成的混和型蛋白，是一个紧密的球状蛋白。在线分析发现存在信号肽,表明其为分泌蛋白，其段裂位点很可能在21或22个氨基酸之间。 为了提高重组溶栓酶的活力，本试验通过易错PCR和交错延伸技术对豆豉溶栓酶的编码基因进行改造。并将得到的突变基因连接到pET-28a(+)载体上，再转化到大肠杆菌菌中，对得到的重组菌进行两步筛选。得到了酶活较出发菌株酶活高的重组菌。 本文还以人血为材料，对酶液进行体外溶血栓实验，结果表明该酶具有溶血栓效果，对红细胞无无毒副作用。是一种良好的潜在溶血栓药物。
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撰写目的和基本思路
- 目的：获得好的第三代溶血栓酶制剂。 基本思路：筛选一株高产溶栓酶菌株，弄清该酶的理化性质，克隆表达该酶，生物信息学分析该酶，体外分子进化技术改造该酶，体外实验该酶的溶血栓效果和毒副作用。
科学性、先进性及独特之处
- 1)该菌株产酶量是目前同类报道中很高的。 2)获得了高纯度的溶栓酶。 3)实现了该酶的高效表达。 4)利用生物信息学全面分析了该酶的一些特征。 5)应用体外分子进化技术，定向选择到的突变酶与底物的亲和力得到提高，催化能力也明显提高。 6)较详细地实验了该酶的体外溶栓效果，溶栓酶体外对人血有明显的抗栓、溶栓作用，而无副作用。具有很好的应用潜力。
应用价值和现实意义
- 目前，我国近2亿人患有心血管疾病，现用的溶栓剂存在毒副作用大、在体内半衰期较短、来源紧缺等缺点，而微生物溶栓酶安全无毒、制备原料丰富，价格低廉，直接高效地溶解纤维蛋白，还可通过消化道直接吸收。 该溶栓酶有明显的抗栓、溶栓作用，且对人的红细胞不产生副作用。因此，豆豉溶栓酶作为良好溶栓剂，具有广阔的开发前景。
学术论文摘要
- 分离到一株高产溶栓酶菌株。分离纯化得到了纯度较高的溶栓酶，并对该溶栓酶的性质进行研究。 利用PCR方法从该菌株的总DNA中扩增出豆豉溶栓酶成熟肽编码区片段。将DFE的编码基因克隆到表达载体pET32a(+)中并转化到E. coli BL21 (DE3)中，从而构建了重组质粒。IPTG诱导表达大量蛋白，经亲和纯化得到较纯的重组溶栓酶蛋白。 通过生物信息学分析表明，该酶编码381个氨基酸，具有典型的溶酶保守区域。等电点为6.325，分子量为27727.802 Da,是a螺旋，β折叠和无规卷曲共同构成的混和型球状蛋白。该酶存在信号肽,表明其为分泌蛋白。 为了提高重组溶栓酶的活力，本试验通过易错PCR和交错延伸技术对豆豉溶栓酶的编码基因进行改造。并将得到的突变基因连接到pET-28a(+)载体上，再转化到宿主菌中，对得到的重组菌进行两步筛选。得到了与底物亲和力提高、催化活力提高的突变株。 本文还以人血为材料，对酶液进行体外溶血栓实验，结果表明，溶栓酶体外对人血有明显的抗栓、溶栓作用，且对人的红细胞不产生副作用，显示出良好的应用前景。
获奖情况
- 本作品2007年于本校获得“校大学生课外学术作品一等奖”。
鉴定结果
- 情况属实。
参考文献
- 1）梅乐和，等．纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化．浙江大学学报（工学版），2004，38(10)：1355~1360。 2）Zhang RH, et al. Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli. Microbiology, 2005, 41: 190-195. 3）Peng Y, et al．Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food．Comparative Biochemistry and Physiology Part B，2003,134: 45~52.
同类课题研究水平概述
- 目前，从豆豉中筛选出的产豆豉溶栓酶的菌株分别有枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。阎家麒等从自制豆豉中筛选出一株在发酵产物中产生高纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌。董明盛等人从豆豉中分离到产溶栓酶高活力菌株，菌种鉴定为枯草芽孢杆菌，并对其产酶的特性进行了较为详细的研究。1996年韩国的Kim等也从韩国传统食品豆酱中分离到产纤溶活性的蛋白酶。1999年我国的李江伟等从豆豉中分离纯化到一种具有较强纤溶活性的酶。韩润林等也从豆豉中分离到一株枯草杆菌，具有较高的溶栓酶活性，精制后比活达到了9800 U/mg，活性回收率为63.8%。四川大学的彭勇等从豆豉中筛选到解淀粉芽孢杆菌DC-4，所产生的溶栓酶能高效地溶解体外血栓，发酵液酶活达820U/mL。 随着这几年对溶栓酶的大量研究，我们已经对该酶的分子量、等电点、稳定性、作用底物有了进一步的了解。阎家麒对其性质进行了研究。运用SDS-PAGE 凝胶电泳测得豆豉纤溶酶的分子量为31 kDa，为一种单链多肽酶。李江伟等采用SDS-PAGE电泳方法初步测定纯化的豆豉纤溶酶的分子量为36 kDa。韩润林等分离得到的溶栓酶的分子量有20、27、28、30 kDa 等多种。 阎家麒还对纤溶酶的稳定性进行了研究，豆豉纤溶酶在40℃以下稳定性良好，50℃，1 h 严重失活，60℃活性全部丧失。酶溶液于-18℃反复冻融5次，活性仍保存95%以上。该酶在pH 7-11 范围内稳定，而在pH值低于5时，很快失活。 用5种合成的小分子作底物来做试验表明，豆豉纤溶酶有其特异的蛋白水解作用和识别位点。李江伟在对人血凝块的实验中发现，用豆豉溶栓酶、尿激酶和生理盐水比较，同等条件下，豆豉溶栓酶血块溶解率2 h大于50%，6 h后溶解率为100%，尿激酶对血块溶解率分别是45%和75%。王金英对豆豉溶栓酶作用进行研究，结果是，剂量为150-300 mg/kg时，具有抑制家兔动脉血栓形成及溶解提取液能明显减少家兔动脉血栓重量，溶解动脉血栓；而小剂量提取液可预防血栓形成。 本研究得到的菌株可以高产溶血栓酶，该酶具有很好的溶血栓作业，并无毒副作业，显示出很好的应用前景。
