基本信息
- 项目名称：
- 基于荧光蛋白标签的“夹心法”重组蛋白生产分离纯化系统
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作B类
- 简介：
- 我们发明的蛋白表达纯化系统是一种基于荧光蛋白的“夹心法”标签表达纯化系统。本发明的蛋白表达纯化系统，是将目的蛋白的两端，在N端连接一个新型荧光蛋白sGFP标签，在C端连接上一个组氨酸His短肽，并加有多核苷酸酶切位点，蛋白全长融合表达。同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶切位点。该系统的目的蛋白表达效率能够得到改进，提高目的蛋白产率，全长蛋白在可见光下为绿色，可以实施监测蛋白表达效果、纯化过程；仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。
- 详细介绍：
- 荧光蛋白有许多优良特性,如非外源因子依赖发光,无种属依赖性,非常高的稳定性,对生物体无毒性,可传代进行遗传分析,因而荧光蛋白在遗传学,发育生物学,神经生物学等学科都有着非常广泛的应用。因此针对现有的蛋白纯化体系中使用的标签无法实时指示目标蛋白在（大肠杆菌菌株中）表达、纯化中的情况，蛋白纯化实验周期长，可控性差的问题，我们由荧光蛋白的一系列良好特性得到启发，利用新型荧光蛋白superfold Green Fluorescnt Protein (sGFP) 构建保有传统标签优点的可视化的生物反应器，打开蛋白工程的“暗箱”，将所构建的具有优良特性的蛋白纯化体系用于生命科学相关研究和应用。 另外，在目前的生物实验教学中，存在着如实验周期长、实验趣味性不高、实验操作流程不明确等问题，因此降低了生物实验对帮助学生加深理论基础认识的作用有限，同时由于本身趣味性、科普性不强，不能使现代蛋白质表达纯化技术被专业外的学生了解和知晓。随着我们构建的该系统的逐步完善，发现通过荧光蛋白进行可视化监控的蛋白表达纯化系统能在某些程度上解决如上的一些问题。经过相关的了解，我们的系统可以在生化实验、基因工程实验等教学使用中，通过全程的可视化示踪降低实验的难度，提高学生兴趣，能让同学们较快理解蛋白表达纯化的全过程及其原理。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 一、设计发明目的和基本思路： 针对现有的蛋白纯化体系中使用的标签无法实时指示目标蛋白在表达、纯化中的情况，同时为了避免蛋白纯化实验周期长，可控性差的问题，我们由荧光蛋白的一系列良好特性得到启发，利用新型超级折叠绿色荧光蛋白荧光蛋白构建保有传统接头优点的可视化的生物反应器，将所构建的具有优良特性的蛋白纯化体系用于生命科学相关研究和应用。而在教学应用方面，我们的系统也可应用在生化、基因工程等教学使用中，通过全程的可视化示踪降低实验的难度，提高实验趣味性，能让同学们较快理解蛋白表达纯化的全过程及其原理。 二、创新点（具体参见下表“科学性先进性”）： 对于基因工程重组蛋白的表达、分离和纯化的“黑箱操作”问题，本作品提出了一种很好的解决办法，使得融合蛋白的表达、纯化进程变得可视可控，实验者可迅速作出判断而无需依赖SDS-PAGE等一系列非常耗时的后续检测实验；而本作品中使用的荧光蛋白标签 + 目的蛋白 + 多聚组氨酸标签的双指示“夹心法”表达纯化体系使融合蛋白的表达过程直观显现，同时显著增加表达产量，使得整个实验流程速度加快，成功率也大大提高。 三、技术关键和主要技术指标： 利用本系统进行蛋白质原核表达和纯化，在蛋白质产量、纯度、生物活性、实验操作难易度、实验过程的可视可控性、实验成本等方面与传统标签的蛋白质表达纯化系统进行综合比较，各项指标均优于传统标签的蛋白表达、纯化系统。
科学性、先进性
- 1.过程可视可控。首次尝试将荧光蛋白作为增溶接头使用并成功应用，在保持传统增溶接头优点的同时利用荧光蛋白良好的非外源因子依赖发光特性使实验的过程变得可视可控，提前知道蛋白表达的情况怎么样，是否断裂表达严重，从柱上分步洗脱的时候在哪几管里，我们不仅能提高我们的实验效率，加速我们的实验进度，还能从经济上节约实验成本。 2.综合性能优异。相比其他种类的荧光蛋白，07年报道的新型荧光蛋白sGFP的溶解性很好，稳定程度更高，并且能帮助融合表达的目标蛋白正确折叠，进一步提高了融合蛋白的溶解度和活性，使得我们构建的蛋白纯化体系不仅在增溶效果、蛋白活性高低等各项性能不输传统的蛋白纯化体系，而且拥有了可视的特性。 3.双接头指示，纯化过程更直观。将sGFP于目标蛋白N端，His接头于C端在大肠杆菌Rossetta表达菌株中融合表达，再将菌液上清通过镍柱富集蛋白。由于只有全长表达的融合蛋白才能结合到镍柱上的同时发射荧光，因此全长表达的融合蛋白量的多少可以通过目测直接判断，在后续纯化实验中也方便跟踪。
获奖情况及鉴定结果
- 一、2009年5月中国遗传学会副理事长余龙教授出具推荐信一封。 二、2009年5月国家教育部生物科学与工程教学指导委员会副主任、生物科学专业分委员会主任、复旦大学生命科学学院原教学副院长乔守怡教授对本项目给予了极高评价，并出具了本项目适合在教学中推广的应用证明。
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 无
作品可展示的形式
- 实物、产品,现场演示,录像
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 一、技术特点和优势 荧光蛋白标签亮度高，稳定，可视化，性质稳定，助折叠，提高目的蛋白溶解性等特点；双标签“夹心法”设计指示蛋白的断裂表达情况；His标签长度根据纯化条件可任意调整；便于目的蛋白替换，操作便捷；实时监控，节省时间和经费；可规模化、产业化，成批操作，带来可观经济效益。 二、适用范围 广泛适用于重组蛋白的表达，分离和纯化，可以用于生物医药，工业生产和科学研究等多方面，还可以用于蛋白表达纯化、基因工程等教学实验。 三、市场分析和经济效益预测 能够实时监控蛋白的表达情况，碰到问题可于第一时间中止实验，以减少不必要的时间延误和经费损失。对商业生产中一些难以表达的蛋白具有一定的帮助。纯化时能够实时跟踪目的蛋白走向，对操作人员不需要高的技术背景及水平要求，重复性和稳定性能进一步保证产业化的实现。设计有多核苷酸酶切位点，方便目的蛋白的替换，操作简易，广泛应用性强，利于拓展潜在市场。
同类课题研究水平概述
- 随着蛋白质-组学研究的深入，将待研究蛋白与增溶标签进行融合表达和纯化已经成为常规手段。而由于荧光蛋白相关的研究开展不久，尤其是新型荧光蛋白sGFP的发现和应用在最近一两年才开始，因此我们与国际领先水平站在同一起跑线上。 目前国际上对目的蛋白前后接多个Tag的很多，如His, MBP, GST等，但是具体应用至商业化生产上的的不算多，而国内用多标签进行商业化生产几乎没有。将新型荧光蛋白sGFP和His作为双标签、“夹心法”运用于蛋白商业生产则未见报道。 荧光蛋白目前被广泛应用于生物学的各个领域，2008年诺贝尔化学奖授予在荧光蛋白上有突出贡献的三位科学家后，荧光蛋白成为了生物大分子中的“明星分子”。但是荧光蛋白的应用多在理论研究上面，无论在国内外应用于商业生产上还不多。新型荧光蛋白sGFP的应用更是刚刚起步，我们将在发展已有研究基础的技术平台的基础上，力争在多方面有所创新。
