基本信息
- 项目名称：
- 创建可消化纤维素的转基因家蚕
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 家蚕为农业经济昆虫，以桑树作为唯一的食物来源。家蚕对桑叶的摄入量非常大，但对桑叶的饲料效力利用率却只有11%左右，大部分纤维素不能利用，而提高家蚕对纤维素的利用率是传统杂交育种方法不能解决的，只有靠外源基因导入才可能得到解决。桑园害虫桑天牛（Apripona germari ）能大量破坏桑树，它能有效地利用桑园木质部作为食物而维系自身的生存，既然桑天牛能以桑树树干作为食物，说明它体内具有消化纤维素的酶体系，经酶活力检测表明其对纤维素有很强的消化能力。将获得的桑天牛纤维素酶基因AgEGaseI运用PiggyBac转基因载体技术通过显微注射导入家蚕蚕卵基因组中，将获得的转基因蚕卵进一步培养筛选，获得了在基因组中含有桑天牛纤维素酶基因，通过培养筛选，在肠道中能够有所表达的家蚕个体，通过基因组PCR，Nothern Blot分析，以及对家蚕组织提取液的酶活鉴定，最终确定获得了能表达桑天牛纤维素酶AgGEaseI的转基因家蚕。
- 详细介绍：
- 目前我国土地资源很紧张，桑院和农作物有土地竞争矛盾。高效农业发展仍然是我国战略举措。因此，本研究目的就是利用较成熟的转基因等生物工程技术结合传统育种方法，将外源性纤维素酶导入家蚕基因组，进而产生可表达外源纤维素酶并可稳定传代的家蚕新品种。这样就可以大大提高土地利用率，为蚕农节约和创收作出贡献。 家蚕(学名：Bombyx mori)是蚕蛾的幼虫，丝绸原料的主要来源，在人类经济生活及文化历史上有重要地位。家蚕是我国重要的经济昆虫之一，为寡食性昆虫，主要以桑叶为食物源，但家蚕对桑叶中含有的纤维素几乎不能被利用。纤维素作为植物细胞壁组成成分之一，占植物干重的35%～50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。但由于天然纤维素呈结晶状、不溶性的刚性结构，一般不能被直接消化吸收。家蚕对桑叶的摄入量非常大，但对桑叶的饲料效力利用率却只有11%左右，大部分纤维素不能利用，这是至今困扰养蚕业的难题之一，也是如何缓解桑园土地压力的难题之一。而提高家蚕对纤维素的利用率是传统杂交育种方法不能解决的，只有靠外源基因导入才可能得到解决。 纤维素酶（cellulase）是一种多组分酶系, 包括葡聚糖内切酶( Endoglucanase, EG) 、葡聚糖外切酶( cellobiohydrolase, CBH) 和β- 葡萄糖苷酶( β- glucosidase, 也称CB 酶或纤维二糖酶)，能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖，进而能被生物体直接利用。纤维素酶来源非常广泛，自然界中多种生物均能产生纤维素酶，利用纤维素作为能量来源。最早在一些食木性节肢昆虫如食木蟑螂，白蚁等肠液中，人们已在其肠液中检测到纤维素酶的活性。随后, 对线虫、贻贝、鲍鱼、甲虫、福寿螺等体内纤维素酶基因进行克隆, 进一步证实了内源性动物纤维素酶的存在。昆虫肠液中的纤维素酶具有高效的纤维素降解活性。可由昆虫自身合成，或由肠液中的共生生物合成，或两者共同合成。 桑天牛（Apripona germari ）属鞘翅目，天牛科，是危害桑树的重要害虫之一。桑天牛幼虫主要位于桑树枝干的皮下和木质部份，以蛀食树干木质成份为生，其活动削弱树势，重者可造成树木枯死。研究发现，桑天牛幼虫的肠液内有着完整的纤维素酶体系，包括β-1,4-内切葡聚糖酶Ⅰ（Ag-EGase I），β-1,4-内切葡聚糖酶Ⅱ（Ag-EGaseⅡ），β-1,4-内切葡聚糖酶Ⅲ（Ag-EGase Ⅲ）。 转基因技术发展至今已经成功的在多个物种上实现了定向改良。继转基因技术在果蝇、蚊子等昆虫中已获得成功后，该技术也已在家蚕中成功使用。目前家蚕转基因技术也已日臻成熟，它不仅可用于功能基因的研究，甚至还是实现利用家蚕合成有用蛋白质、开发家蚕生物反应器，成为利用功能基因开发新的蚕品种的关键技术。作为昆虫转基因技术中重要的一环hermes, hobo, mariner, minos 以及 piggyBac等转座子相继被用于家蚕转基因研究。其中piggyBac因可较完整地整合到家蚕基因组中，目前是比较常用的家蚕转基因载体。而用于阳性个体筛选的依据则是根据载体上连接的荧光蛋白基因的表达。 通过生物信息学分析和PCR实验验证，我们从获得了桑天牛中肠中获得了纤维素酶AgEGaseI的开放阅读框（ORF）的全长cDNA序列，对其特性及产物特性进行了分析比对，并根据获得的基因序列设计引物，通过PCR手段获得了桑天牛纤维素酶AgEGaseI的基因序列。将其进行测序，结果显示获得的桑天牛纤维素酶基因AgEGaseI开放阅读框（ORF）与GeneBank中所公布的序列一致，确定了所获得的纤维素酶基因片段的正确性。对其进行原核与真核表达并通过资料的检索，确定了其酶活以及其表达的可能性，最终将获得的AgEGaseI基因片段连入转基因载体pBac[3×P3-EGFPafm] plasmid上，利用电转化和穿刺接种法，将该转基因载体导入家蚕秋风品系产卵4小时内的受精卵内，将经过转基因操作后的蚕卵在25℃且培养环境湿度达到饱和状态的无菌环境中培养。通过对G0-G1代家蚕的幼蚕进行体外的观测，并取所获得的幼蚕基因组进行PCR鉴定，相比较之未进行转基因操作的家蚕，在PCR结果和体外荧光检测过程中均证实了获得了基因组中含有目的基因AgEGaseI的转基因家蚕。为了进一步检测转基因的成功与否，将经过转基因操作的家蚕与未进行转基因操作的家蚕作为对照，提取其中肠组织进行低温研磨，提取其匀浆液离心去除杂质后，滴加在含有羧甲基纤维素钠（CMC）为底物的平板上，根据是否形成空斑对其是否含有纤维素酶活性进行评估，结果显示在经过转基因操作的家蚕肠道内，表现出微弱的纤维素酶活性。至此，本次实验已达到了预期的目的，在经过转基因操作后，获得了含有桑天牛纤维素酶基因，并能够进行表达的家蚕。通过接下来的筛选和回交，预期将获得能够大量表达纤维素酶活性，并对桑叶纤维素更有效利用的家蚕新品种。 本实验利用先进的转基因手段，巧妙地将外源纤维素酶基因转入对家蚕品系进行定向的改良，并获得了成功。本实验的成功表示明着转基因技术在家蚕养殖品种的定向培育和种质改良方面有着巨大的潜力，利用转基因技术获得的符合人们愿望的转基因生物已经成为可能。同时也为纤维素酶基因在其它物种上有效利用提供非常好的借鉴作用此次实验的实际意义在于利用可表达纤维素酶的家蚕品系来缓解如今土地资源紧张的与蚕桑养殖业对桑叶的需求量日益加大之间的矛盾，为以后开发节能高效性蚕桑养殖提供了思路。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 家蚕是我国重要的经济昆虫之一，为寡食性昆虫，主要以桑叶为食物源，家蚕对桑叶的摄入量非常大，但对桑叶的饲料效力利用率却只有11%左右，大部分纤维素不能利用。提高家蚕对纤维素的利用率是传统杂交育种方法不能解决的，只有靠外源基因导入才可能得到解决。因此，本研究的目的就是利用较成熟的转基因等生物工程技术，将外源性纤维素酶导入家蚕基因组，进而产生可表达外源纤维素酶并可稳定传代的家蚕新品种。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：利用较成熟的转基因生物工程技术，将外源性纤维素酶导入家蚕基因组，进而产生可表达外源纤维素酶并可稳定传代的家蚕新品种。 先进性及独特之处：家蚕与桑天牛在分类学上虽为不同目，但同为以桑树为生存的昆虫。因此，设想将桑天牛纤维素酶基因转移到家蚕体内会有很好的适应性,该思路是科学的。目前全世界养蚕科学家未开展本研究或没这样构想，本研究采用的转基因方法也是先进的，研究内容是独特的。
应用价值和现实意义
- 目前我国土地资源很紧张，桑园和农作物有土地竞争矛盾。高效农业发展仍然是我国战略举措。因此，本研究目的就是利用较成熟的转基因等生物工程技术结合传统育种方法，将外源性纤维素酶导入家蚕基因组，进而产生可表达外源纤维素酶并可稳定传代的家蚕新品种。这样就可以大大提高土地利用率，为蚕农节约和创收作出贡献。
学术论文摘要
- 在桑天牛中肠中获得了纤维素酶AgEGaseI的开放阅读框的全长cDNA序列，对其特性产物特性进行分析比对，并根据获得的基因序列设计引物。提取桑天牛幼虫基因组cDNA为模板，对AgEGaseI基因进行PCR扩增。获得了和预测大小一致的条带，进行回收后连接T载体进行测序，测序结果和预期相符。设计真核引物并以T载体为模板，将将扩增片段该基因连接到HTb载体，转化含AcBacmid的DH10，蓝白斑筛选后将正确转座的质粒转染Sf9细胞进行真核表达，经过产物分析和酶活检测确定了在真核Sf9细胞中表达出了含β-1，4-糖苷内切酶水解活性的纤维素酶。采用本实验室培育的家蚕为转基因对象，对刚产下的家蚕卵进行转基因显微注射，通过荧光标记筛选鉴定，成功地获得了导入带有纤维素酶外源基因的家蚕个体，对含有外源基因家蚕个体进行组织酶活鉴定，在其中肠内能检测到了纤维素酶活性，最终成功获得了表达纤维素酶的转基因家蚕。
获奖情况
- 1.作者，利用电穿孔法构建含桑天牛纤维素酶基因的转基因家蚕《江苏大学学报》 录用 2.作者，一种新的家蚕信息素相关蛋白基因BmP218的生物信息学分析及功能预测《生物技术通讯》 录用 3.导师，作者，Isolation and characterization of a partial pumilio gene with complete PUF-domain in silkworm Bombyx mori African.Entomology SCI收录 4.导师，作者，A genome-wide survey on basic helix-loop-helix transcription factors in rat and mouse SCI收录 5.导师，作者Phylogenetic Analysis of Zebrafish Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors SCI收录 6.专利：基于piggyBac创建可利用桑叶纤维素的转基因家蚕 提交
鉴定结果
参考文献
- 1.Prabavathy V.R, Mathjvanan N, Sagadevan E. Intrn-strain protoplast fusion enhances carbaxymethyl cellulose activity in Trichoderma reesei. Enzyme and Microbial Technology 2.Hideo Toyama, Naotsugu Yamagishi, Nobuo Toyama, Construction of cellulose hyper-producers of Trichoderma reesei Rut C-30 for utilization of waste paper using colchicina and benotnyl [J]. Journal of Moleular Catalysis B: Enzymic 3.Adsul M.G, Bastawde, K.B, Varma A.J,et al.Strain improvement of Penicillium janthinelum NCIM 1171 for increased cellulose production. Bionesource Technology 4.Rlaan Den Haan, Shaunjta H Rose, Lee R Lynd, et al. Hydrolysis and fermentation of amcrphous cellulase by recombinant Saccharomyces cerevisice. Metabobic engineering. 5.Watanabe, H., Noda, H., Tokuda, G. A cellulase gene of termite origin. Nature 6.Lee S J, Kim S R, Yoon H J, et al. cDNA cloning,expression, and en zymatic activity of a cellulase from the mulberry longicorn beetle, apriona germari [J]. Biochem Mol Biol
同类课题研究水平概述
- 纤维素占植物干重的35%～50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，但不能被直接利用吸收。纤维素酶（cellulase）是一种多组分酶系，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖，进而能被生物体利用。迄今已从三种甲虫体内分离出内生性纤维素酶，桑天牛属于其中一种。桑天牛（Apripona germari）属鞘翅目，天牛科，是危害桑树的重要害虫之一。桑天牛幼虫主要位于桑树枝干的皮下和木质部份，以蛀食树干木质成份为生，其活动削弱树势，重者可造成树木枯死。研究发现，桑天牛幼虫的肠液内有着完整的纤维素酶体系，其中Ag-EGaseⅢ在55℃和pH值6的环境中活性最高，在60℃时该酶可保持稳定10分钟，这与另两种酶非常相似。从热稳定上，Ag-EGaseⅢ与Ag-EGaseⅡ相似。而从酶活性上，Ag-EGaseⅢ与Ag-EGaseI相似。虽然从酶特性上三种纤维素酶存在一定的差异，但根据种系发生关系及蛋白结构又可同归于糖基水解酶45家族。三种纤维素酶主要表达于前肠和中肠，通过协同作用共同水解纤维素。 继转基因技术在果蝇、蚊子等昆虫中已获得成功后，该技术也已在家蚕中成功使用。目前家蚕转基因技术也已日臻成熟，它不仅可用于功能基因的研究，甚至还是实现利用家蚕合成有用蛋白质、开发家蚕生物反应器，成为利用功能基因开发新的蚕品种的关键技术hermes, hobo, mariner, minos 以及piggyBac等转座子相继被用于家蚕转基因研究。其中piggyBac因可较完整地整合到家蚕基因组中，目前是比较常用的家蚕转基因载体。载体的筛选标记是检测转座成功与否的重要方面，人工启动子3×P3可启动子EGFP或DsRed等荧光蛋白在家蚕视细胞表达，方便了转基因家蚕的筛选工作。目前应用于家蚕的转基因方法有显微注射法、基因枪法、电穿孔法、脂质体法、精子介导法、压力渗透法、扎卵法等。我们实验室从2005年开始建立家蚕转基因技术体系，目前比较成熟的方法主要是显微注射和基因枪法。 综上所述，桑天牛幼虫寄生于桑树枝干，生活习性与家蚕幼虫的类似，其纤维素酶组分合理，酶活性非常适合桑叶纤维素的分解。对于桑天牛纤维素酶的应用，特别是通过转基因方法将导入家蚕基因组的研究，国内外尚未见类似报道。本研究成果的应用对于提高桑园土地利用率和桑叶的利用率，增强我国丝绸产业国际竞争力方面将具有重要的意义。
