基本信息
- 项目名称：
- 白菜、甘蓝中决定花色等重要性状的F3'H基因的克隆与分析
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究首次克隆了白菜和甘蓝这两个芸薹属重要物种的F3'H基因的全长cDNA和基因组序列，对其基因和编码蛋白的结构和功能进行了系统的生物信息学分析，表明它们属于典型的F3'H基因，也发现了一些重要的分子生物学现象，如可变性转录起始位点和加尾位点。对白菜、甘蓝、甘蓝型油菜、拟南芥的F3'H基因进行了属内和属间比较基因组学分析，表明白菜和甘蓝的确是甘蓝型油菜的基因供体，芸薹属祖先中F3'H三倍化加倍后可能发生了基因丢失象。因此，本研究有利于阐明白菜、甘蓝、甘蓝型油菜这3个物种的类黄酮性状如观赏花色、异花授粉、茎叶着色、种皮色泽、食用器官中类黄酮保健成分含量等的分子机理，也通过转基因和功能基因分子标记辅助育种改良这些性状提供了目标基因。
- 详细介绍：
- 研究背景：类黄酮3'羟化酶(F3'H)是类黄酮物质生物合成的关键酶，参与决定花色、种皮色泽、茎叶表面花青素苷着色等重要性状; 研究内容：分别克隆白菜和甘蓝的全长F3'H基因，预测基因及其编码蛋白的结构特征、潜在功能和比较基因组学特征; 主要结果：所克隆的白菜F3'H（BrF3'H）和甘蓝F3'H（BoF3'H）的全长基因分别为3067bp和3128bp，都有3个GT/AG型内含子，前导序列富含C而缺乏G且包含一个Kozak序列，3'UTR有多处poly(A)加尾信号。BrF3'H和BoF3'H的全长cDNA分别为1871bp和1874bp，ORF均为1536bp，编码511个氨基酸，蛋白分子量均为56.6kD，等电点均为7.1。预测BrF3'H和BoF3'H是典型的细胞色素P450蛋白，均有信号肽，有2个跨膜域，定位于内质网膜上，并存在磷酸化修饰，二级结构主要由α-螺旋和随机卷曲组成。系统发生分析和多重比对表明，BrF3'H和BoF3'H是拟南芥和甘蓝油菜F3'H的垂直同源基因。电子克隆分别显示了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的1、1、2条F3'H基因，暗示芸薹属祖先中F3'H三倍化加倍后可能发生了基因丢失现象。
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撰写目的和基本思路
- 基本思路：设计白菜、甘蓝全长基因扩增引物；提取总RNA和总DNA，反转录获得总cDNA第一链；PCR扩增F3'H基因的全长cDNA和DNA，琼脂糖凝胶电泳后，胶回收，连接，转化大肠杆菌，测序；对测序结果进行生物信息学分析。 目的：通过生物信息学分析预测该基因及其编码蛋白的结构特征、潜在功能和基因进化特点，对白菜、甘蓝、甘蓝型油菜、拟南芥的F3'H基因进行属内和属间比较基因组学分析。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：(1)首次克隆了白菜、甘蓝的全长F3'H基因(2)揭示了芸薹属F3'H的进化和比较基因组学特点(3)有助于阐明芸薹属植物类黄酮性状的分子机理和推动分子育种。 先进性：在研究手段和研究方案的制定和论文写作中，综合采用了分子生物学、分子遗传学、生物信息学、比较基因组学、分子进化等学科的新理论和新方法。 独特性：利用了电子克隆这一新技术辅助引物设计。
应用价值和现实意义
- 现实意义：本研究有利于阐明白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的花色、种皮色泽、类黄酮保健成分等的分子机理，为分子育种提供目标基因。 实际应用价值：芸薹属白菜、甘蓝、甘蓝型油菜是重要蔬菜、油料或观赏作物，也是作物进化和比较基因组学研究热点。类黄酮是植物界的重要次生物质，影响多种性状。而决定花色等性状的类黄酮的产生均需类黄酮3'-羟化酶/F3'H的参与，F3'H对芸薹属具有重要的生物学功能和作物学价值。
学术论文摘要
- 类黄酮3'-羟化酶(F3’H)参与决定花色、种皮色素和茎叶着色等性状。本研究克隆了3067bp的白菜 F3’H(BrF3'H)和3128bp的甘蓝F3’H (BoF3’H)全长基因，它们都有3个内含子，前导序列有典型Kozak结构，5'UTR富含C而缺乏G，3'UTR有多处可能的poly(A)加尾信号。BrF3’H全长cDNA1871bp，编码511个氨基酸，蛋白分子量56.64kD，等电点7.10。BoF3’H全长cDNA1874bp，编码511个氨基酸，蛋白分子量56.57kD，等电点7.08。预测BrF3’H和BoF3’H是典型的细胞色素P450，具有F3'H的所有特征基序，均有一个信号肽和至少2个跨膜域，定位于内质网膜上，可能存在磷酸化修饰，二级结构主要为α-螺旋和随机卷曲，α-螺旋主要位于蛋白的中部。BrF3’H和BoF3’H与甘蓝型油菜和拟南芥的F3’H高度同源，互为垂直同源基因，与其它F3’H基因也广泛同源。GenBank序列标签和本研究均显示白菜、甘蓝、甘蓝型油菜分别仅有1、1、2个F3’H基因，暗示在芸薹族祖先中F3’H三倍化后可能发生了部分水平同源基因的丢失。
获奖情况
- 2009年6月，第十一届“挑战杯”全国大学生学术科技作品竞赛重庆赛区一等奖
鉴定结果
- 2009年6月15日教育部科技查新工作站查新结论：在国内外检出文献中，未见如委托查新项目白菜、甘蓝中决定花色等重要性状的F3’H基因的克隆与分析一样的相关研究报道，也未见相关专利申请。
参考文献
- Johnston JS, Pepper AE, Hall AE, et al. (2005) Evolution of genome size in Brassicaceae. Ann Bot, 95: 229–235. Xu B-B, Lia J-N, Zhang X-K, et al. (2007) Cloning and molecular characterization of a functional flavonoid 3'-hydroxylase gene from Brassica napus. J plant physiol, 164: 350–363.
同类课题研究水平概述
- 白菜(B. rapa)包含重要的油料和蔬菜作物，甘蓝(B. oleracea)包含了重要的蔬菜和观赏作物，由白菜和甘蓝天然杂交加倍而成的异源四倍体物种甘蓝型油菜(B. napus)是世界上重要的油料作物，它们均具有重要的经济和理论研究价值。 类黄酮是广泛存在于植物界的重要次生物质，影响多种性状。芸薹属花瓣和花粉的色素主要为黄酮醇，与吸引昆虫异花授粉、繁殖种子紧密相关，也赋予了花的观赏价值；黄酮醇等还是白菜、甘蓝等蔬菜的保健成分，在人体内能清除自由基和增加抗氧化性；紫菜苔、羽衣甘蓝的观赏性色素是花青素苷，它也是天然色素，在人体内也具有抗氧化活性；原花青素是种皮色素的主要成分，降低种皮色素可以减少菜籽油的色素污染，提高饼粕的饲用价值。上述各种类黄酮物质的生物合成均需要黄酮3'-羟化酶（F3'H）的参与，F3'H对于芸薹属具有重要的生物学功能和作物学价值。 F3'H基因已在多种植物中被克隆。拟南芥中，F3'H的突变导致种皮颜色由野生型的深褐色改变为苍白色，称为透明种皮7(transparent testa 7, tt7)位点。大豆中，F3'H的突变影响种皮和表皮毛中的色素成分。通过F3'H转基因改变花色方面也取得了初步效果。 白菜和甘蓝F3'H基因尚未被克隆。纵观国内外，整个芸薹属植物的异花授粉、观赏花色、茎叶着色、种皮色泽、食用器官的类黄酮保健成分等性状的分子机理研究方兴未艾，相应的分子育种几乎还是空白。本课题组已完成了甘蓝型油菜BnF3'H-1等基因的全长克隆。研究F3'H有助于阐明白菜、甘蓝和甘蓝型油菜上述性状形成的分子机理，为这些性状的分子育种奠定基础。 近年来大量的比较基因组研究表明，芸薹族祖先中发生了基因组的三倍化，芸薹属二倍体基本种和四倍体复合种中应当分别约有3条和6条垂直同源基因与拟南芥的每条功能基因相对应。本课题组此前的研究表明甘蓝型油菜中可能只有2条左右的F3'H基因，这与三倍化假说相矛盾，因此克隆白菜和甘蓝的F3'H也有助于阐明芸薹属F3'H的进化和比较基因组学特点。 本研究以白菜的白菜型油菜亚种(ssp. oleifera)、甘蓝的羽衣甘蓝亚种(ssp. acephala)为材料，在电子克隆辅助引物设计下，分别克隆了一条全长F3'H基因，并对其进行了系统的序列分析和初步的比较基因组学分析。国际国内没有与本文内容相似的研究报道。
