基本信息
- 项目名称：
- 大肠杆菌内基因计时开关的设计及应用
- 来源：
- 第十一届“挑战杯”国赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 大肠杆菌内基因计时开关的设计及应用 分类：科技发明制作，D类 摘要： 大肠杆菌是目前应用最为广泛的外源蛋白表达体系，该体系通常采用单一启动子调控目的蛋白表达，这种调控往往是一不可逆过程。而生物体内有许多蛋白只在一段时间内进行表达的，因而建立一种简单可控的基因开关模型，对研究这些蛋白的表达与功能具有重要意义。 本发明设计了一种“基因计时开关”用以控制大肠杆菌在某一时段内表达特定目的蛋白。基因计时开关是一个由阿拉伯糖操纵子和乳糖操纵子组成的基因反馈调节回路，模型中以绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白(RFP)为报告基因，显示其工作状态（见项目图片1)。 当培养基中没有阿拉伯糖时，阿拉伯糖操纵子处于阻遏状态，乳糖操纵子控制RFP表达，开关处于“关闭”状态；当培养基中加入阿拉伯糖后，阿拉伯操纵子解阻遏启动GFP表达，显示开关打开。同时表达LacI阻遏乳糖操纵子，关闭RFP的表达。当阿拉伯糖完全降解后，基因计时开关重新关闭。 该发明于2008年11月8～9日在由美国麻省理工学院主办的国际基因工程机器设计竞赛（iGEM）中获得铜奖。
- 详细介绍：
- 大肠杆菌内基因计时开关的设计及应用 摘要： 利用合成生物学的方法，在大肠杆菌中构造一个稳定、可控的“基因计时开关”，通过本发明设计，基因生物计时开关可以对大肠杆菌外的L-阿拉伯糖分子浓度信号做出响应，从而实现对计时开关的定时控制。这一发明可以调控大肠杆菌在某一特定时段内表达特定目的蛋白，不仅可以用于对瞬时表达蛋白质的功能研究，也在工业发酵中利用大肠杆菌对外界调控因素的响应实现精密的自我调控。 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，培养条件简单，操作方法简便，是目前生物技术领域应用最为广泛的表达体系。用大肠杆菌表达外源性蛋白的时候，通常采用单一启动子进行调控，即：当大肠杆菌生长到一定时期，加入诱导剂或改变外界环境因素，诱导目的基因的表达。但这种调节往往是单向的，不可逆的过程。而生物体内有许多蛋白的表达是时序性的，即：只在特定条件下，或特定时间段内进行表达。因而，建立一种简单可控的基因开关模型，对研究这些瞬时表达的蛋白质的功能具有重要意义。 为了使大肠杆菌内的外源蛋白能进行可调控的时序表达，我们设计了一种“基因计时开关”，这种计时开关可以控制大肠杆菌在某一特定时段内表达特定目的蛋白，可以用于对瞬时表达蛋白质的功能研究。 基因计时开关其基本组成如图1所示（见项目图片1）： 其中：araC+PBAD为阿拉伯糖操纵子，LacI为乳糖操纵子的调节基因，PL是乳糖启动子，GFP为绿色荧光蛋白，RFP为红色荧光蛋白。 根据上述目的基因构建“基因计时开关”的质粒图谱如图2所示(见项目图片2)，其工作原理是在大肠杆菌中构建一个由阿拉伯糖操纵子和乳糖操纵子组成的基因反馈调节回路，同时以绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白(RFP)为报告基因，显示基因计时开关的工作状态。 基因计时开关主要工作原理是以可以解除阿拉伯糖操纵子阻遏状态的阿拉伯糖作为调控分子，控制计时器的开关状态和工作时间。当培养基中没有加入L-阿拉伯糖时，阿拉伯糖操纵子处于阻遏状态，乳糖操纵子控制RFP的表达，表明基因计时器处于“未计时”状态；当在培养基中加入一定浓度的L-阿拉伯糖后，阿拉伯操纵子解阻遏，调节基因LacI表达，使乳糖操纵子受到阻遏，抑制RFP的表达，同时阿拉伯糖启动子启动GFP的表达，显示计时开关开始计时。当培养基中L-阿拉伯糖完全降解后，阿拉伯糖操纵子重新回到阻遏状态，阻断GFP的表达，乳糖启动子再次启动RFP的表达，此时基因计时器完成计时工作。 报告基因的表达顺序和状态如下图所示(见项目图片5)： 同时，我们可以通过调节L-阿拉伯糖的浓度来调控基因计时开关工作时间的长短，从而达到为计时开关定时的目的。另外，在基因计时开关工作过程中，菌体培养的温度、培养基的成分也会对计时周期的长短产生影响。在实际应用中，可以用某些目的基因替换GFP和RFP报告基因，从而使不同蛋白在大肠杆菌内进行可控的顺序表达。 本发明可以使大肠杆菌内的外源蛋白能进行可调控的时序表达，可用于研究瞬时表达蛋白质的功能。此外，也可利用大肠杆菌对外源调控分子的响应，实现工业发酵中的自响应式的自动控制。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 设计目的：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，培养条件简单，操作方法简便，是目前生物技术领域应用最为广泛的表达体系。为了使大肠杆菌内的外源蛋白能进行可调控的时序表达，我们设计了一种“基因计时开关”，这种计时开关可以控制大肠杆菌在某一特定时段内表达特定目的蛋白，不仅可以用于对瞬时表达蛋白质的功能研究，也在工业发酵中利用大肠杆菌对外界调控因素的响应实现精密的自我调控。 基本设计思路：“基因计时开关”的工作原理是在大肠杆菌中构建一个由阿拉伯糖操纵子和乳糖操纵子组成的基因反馈调节回路，同时以绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白(RFP)为报告基因，显示基因计时开关的工作状态。通过调节L-阿拉伯糖的浓度来调控基因计时器工作时间的长短，从而达到为计时器定时的目的；另外菌体培养的温度、培养基成分也对基因计时器工作时间的长短有影响。在实际应用中，可以用某些目的基因替换GFP和RFP报告基因，从而使不同蛋白在大肠杆菌内进行可控的顺序表达，用于某些蛋白质瞬时表达模型的研究。 创新点：利用两个精密调控的操纵子使大肠杆菌内目的基因能进行时序调控性表达，并使之能够对外界调控分子做出响应，可根据需要控制目标蛋白实现一定时段的定时表达。这一调控模型可用于某些瞬时表达蛋白的功能研究，同时也可用于大肠杆菌发酵表达的自动控制。 技术关键：通过阿拉伯糖操纵子和乳糖操纵子构建一个精密调控的反馈回路，利用阿拉伯糖操纵子精密调控、易于诱导的性质实现目的蛋白的时序性表达。
科学性、先进性
- 目前，大部分利用大肠杆菌对目的蛋白的表达的调控手段是利用单一启动子进行调控，在加入某种诱导剂后诱导蛋白表达，但这种诱导表达通常是单向的、不可逆的。 本发明利用了两个精密调控的启动子，通过反馈回路实现了目的蛋白表达的时序性调控，使目的蛋白可以在一段可控的时间段内进行表达，并可以在大肠杆菌的生长周期内重复开关此目的蛋白的表达。此模型不仅可以用于大肠杆菌发酵过程的控制，也可用于某些瞬时表达的蛋白质功能的研究。
获奖情况及鉴定结果
- 该作品于2008年11月8～9日在由美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology，MIT）主办的国际基因工程机器设计竞赛（International Genetically Engineered Machine Competition，iGEM）中获得铜奖
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
作品可展示的形式
- 图片
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 本发明的主要技术优势是实现了大肠杆菌发酵过程中目的蛋白表达的时序性控制。使目的蛋白可以在一段可控的时间段内进行表达，并可以在大肠杆菌的生长周期内重复开关此目的蛋白的表达。 本发明一方面可以用于大肠杆菌发酵过程的控制，利用大肠杆菌对调控分子的响应，实现自响应式的表达调控，在工业发酵的自动控制中能获得良好的应用前景。同时，本发明也可用于建立某些瞬时表达的蛋白质功能研究的模型，为蛋白质结构与功能研究提供了一种有效而方便的基因调控模型。
同类课题研究水平概述
- 合成生物学是新出现的一门交叉学科，具有迅猛的发展势头和广阔的发展前景。它借鉴工程化的思想来研究生命，最终目标是创造人工生命体，涵盖分子生物学、工程学、数学、物理学等许多研究领域。 在国外合成生物学的研究受到科技发达国家的高度重视，在美国和瑞士已成功地召开了三届国际合成生物学会议, 欧洲首届合成生物学会议也于2007年底在西班牙成功召开, 著名的美国洛伦兹•贝克莱国家实验室在国际上首次建立了合成生物学部等等。2000年以来, 国外的合成生物学取得了很大进展, 2004年“合成生物学”被美国MIT出版的Technology Review评为将改变世界的10大新出现的技术之一。例如有学者利用基因表达调控元件构成了生物逻辑门、振荡器、反馈回路等组件。有学者根据细胞外部或内部某些特定参数的变化来控制细胞的生长、分化和代谢等生命活动的设计实现了非天然的信号转导。You等设计的对菌体密度敏感的调控网络能导致细菌死亡,从而实现对大肠杆菌生长密度的调控。麻省理工学院的研究人员获得了能对不同光照条件做出应答的大肠杆菌。利用代谢工程技术改造细胞代谢途径来合成复杂化合物的方法,将大大降低药品或者材料的生产成本,直接造福大众。例如, Keasling等向大肠杆菌中导入了来自苦艾草、酿酒酵母等其他物种的10个基因,改造后的代谢系统表达出了能治疗疟疾的青蒿素等类萜类化合物。 相对于国外对合成生物学的重视程度,国内的合成生物学的发展才刚刚起步，中国科学院合成生物学重点实验室于2009年2月2日正式获批在上海成立，国内在该领域还没有相关研究成果的报道，从国内中文期刊数据库以“ 合成生物学”为关键词只有几篇综述短文。合成生物学有巨大的理论研究价值和实际应用价值,其试验成果将会产生巨大的经济效益,具有广阔的应用前景。 本发明利用合成生物学的方法，在大肠杆菌中构造一个稳定、可控的“基因计时开关”，通过本发明设计，基因生物计时开关可以对大肠杆菌外的L-阿拉伯糖分子浓度信号做出响应，从而实现对计时开关的定时控制。这一发明可以调控大肠杆菌在某一特定时段内表达特定目的蛋白，不仅可以用于对瞬时表达蛋白质的功能研究，也在工业发酵中利用大肠杆菌对外界调控因素的响应实现精密的自我调控。
