基本信息
- 项目名称：
- 槲皮素诱导HeLa细胞凋亡及Caspase-3、-8活化对凋亡影响的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 采用噻唑蓝（MTT）法观察槲皮素对人宫颈癌HeLa细胞和正常人肝L-02细胞的生长抑制作用；DAPI染色观察细胞的形态学变化；DNA琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段化分析，荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡情况；比色法测定细胞凋亡过程中caspase-3、-8活性变化。本研究可为进一步探索槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制提供理论线索，并且为研制新型具有抗肿瘤作用药物奠定基础。
- 详细介绍：
- 随着人类生态环境的日益恶化，肿瘤已经成为人类的主要杀手。而宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌位居第二，每年全球死于宫颈癌的妇女约有20万，中国占10%左右。在发展中国家，尤其是亚洲、南美洲、非洲的一部分地区，宫颈癌则属于常见并多发的妇科肿瘤，并且，宫颈癌发病率逐年上升，趋于年轻化。在我国宫颈癌的分布主要在中部地区，且农村高于城市，山区高于平原，农业人口高于非农业人口；从内蒙古、山西、陕西、湖北、湖南到江西，形成一个高发地带。从人群年龄分布来看，在20岁以前，宫颈癌的发病率较低；20～50岁增长较快，其后上升辐度较缓。我国普查发现的宫颈癌发病年龄多为40～55岁，60～69岁又有高峰出现。在临床上，宫颈癌的常规治疗方法包括外科手术切除、放射线治疗以及化学治疗等方法；对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者均不宜手术治疗，手术后也容易转移和复发，并且放疗和化疗对人体的副作用也相对较大，这使人们更深刻地认识到开发具有良好抗癌作用药物的重要性和紧迫性。因此，及早预防、治疗宫颈癌，寻找一种切实有效的抗肿瘤药物（尤其以中草药为首选），是摆在每位科研工作者面前的重要任务。我国地大物博，具有丰富的中草药资源，研究具有抗肿瘤活性的中草药，更具社会效益和经济效益。 槲皮素（Quercetin）是一种自然界存在的黄酮类化合物（化学名为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮），广泛存在于自然界各种植物的花、叶和果实之中，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮。在芒果、苹果、葡萄、樱桃、梨、等植物中，均富含这一物质，在我国资源十分丰富，易于提取、分离和检测。 槲皮素是一种黄色粉末状固体或晶体，分子中有5个酚羟基，呈弱酸性，在酸性条件下可稳定存在，在碱性条件下不稳定，很快转化为有机醌化合物，使其稳定性下降。高氧环境、金属离子等也可以影响其稳定性。以大豆蛋白、乙基纤维素、单硬脂酸甘油酯作为复合壁材，将槲皮素制成微胶囊产品，结果发现微胶囊化可以明显提高槲皮素稳定性，并减弱pH的影响和氧气对槲皮素的氧化降解。槲皮素分子呈平面结构，晶体以平面紧密重叠堆积，导致其虽然有5个羟基，但却几乎不溶于水，极大地限制了其在体内的吸收和生物利用度，可能由于其空间结构的原因较难通过胃肠道黏膜。有研究表明，将槲皮素制成水溶性的前体药物，志愿者口服给药，在其血液中并未测到槲皮素或其在体内的代谢产物葡萄糖醛酸酯或硫酸酯化物，说明该水溶性的前体并不能改善槲皮素的口服吸收，而且进行化学修饰后的槲皮素结构极不稳定，降低了其抗肿瘤的效果。因此，提高槲皮素的溶解度，增加其口服吸收，提高生物利用度是槲皮素应用中亟待解决的问题。 槲皮素对人体具有十分重要的生理作用，如扩张冠状动脉、降低毛细血管通透性和脆性、降血脂、抗血小板聚集、抗炎抗病毒、抗过敏、镇痛、抗氧化清除自由基、调节免疫功能等作用[1,2]。自1971年NCL首次发现槲皮素对P388白细胞具有抑制作用以来，国内外学者十分关注槲皮素的抗肿瘤作用。近年来研究表明，槲皮素对膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖也具有明显的生长抑制作用，呈现出一定的抗肿瘤效应[3-7]，槲皮素对肿瘤的化学预防和治疗作用格外引人瞩目，其可以全面地作用于癌发生的始发、促癌和演进3个阶段，兼有抗致癌、抗促癌和诱导分化的作用。 研究表明，肿瘤的始发起因于细胞受到致癌因素的多次攻击，DNA受损而发生突变，国际癌症中心曾指出，80％-90％的人类肿瘤是由化学致癌物引起的。在环境中广泛存在的多环芳烃、芳香胺类、亚硝胺及黄曲霉毒素等都为间接致癌物(或称为致癌前体物)。对肿瘤的化学预防则是指用药物抑制肿瘤的发生或使肿瘤分化逆转，天然的化合物槲皮素也可作为化学预防剂，可以通过抑制间接致癌物活化所需的以细胞色素P450为主的微粒体混合功能氧化酶以及其它毒物代谢酶，从而使它们不能转变为化学性质活泼的终致癌物，进而阻止细胞癌变的发生。并且，槲皮素是有效的抗氧剂，通过阻断细胞膜脂类的过氧化过程，而减轻氧自由基对细胞的损害，保持细胞的正常状态。在槲皮素对肿瘤的治疗作用方面，目前已有体外实验研究报道，槲皮素能显著抑制多种恶性肿瘤细胞的生长，并能诱导肿瘤细胞凋亡，如：人卵巢癌细胞、多种胃癌细胞、结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、白血病细胞、人肝癌细胞、人黑色素瘤细胞等。但槲皮素对人宫颈癌HeLa细胞的抗肿瘤的研究虽有少量报道，但大多停留在槲皮素对肿瘤细胞的生长抑制作用层面，对某些信号分子的调控研究也尚末涉及。因此，深入了解槲皮素对肿瘤细胞的抑制作用及其机制，对进一步开发新型具有抗肿瘤作用的中药具有重要而深远的意义。 本作品我们拟人宫颈癌HeLa细胞为药物作用模型，观察槲皮素对HeLa细胞的生长抑制、诱导细胞凋亡以及caspase-3、-8活性变化对凋亡的影响，为进一步探索槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制提供理论线索。
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撰写目的和基本思路
- 目的：研究槲皮素诱导HeLa细胞（人宫颈癌细胞）凋亡的作用，以及caspase-3、-8活化对凋亡的影响；揭示槲皮素诱导人宫颈癌细胞凋亡机制及涉及的细胞凋亡的caspase途径，以探讨中草药槲皮素的抗肿瘤作用；并利用我国丰富的中药材资源，开发成中草药抗肿瘤制剂。 基本思路：1、槲皮素体外抗肿瘤作用；2、槲皮素在动物体内抗肿瘤生长的抑制作用；3、槲皮素固体脂质纳米粒制剂研究。
科学性、先进性及独特之处
- 观察槲皮素对HeLa细胞和正常人肝细胞株（L-02）的生长抑制作用，并比较分析；采用定性和定量试验检测细胞凋亡情况及凋亡过程中caspase-3、-8活性变化，从而全面、系统、科学地确定槲皮素可特异性地诱导人HeLa细胞凋亡及其诱导凋亡机制；并将建立人宫颈癌小鼠模型，进一步阐述槲皮素对荷瘤小鼠移植瘤生长抑制作用，确定其在体内的抗肿瘤活性及药代动力学和药效动力学，为新型抗肿瘤药物的开发奠定基础。
应用价值和现实意义
- 本作品明确了槲皮素可成功诱导人宫颈癌细胞凋亡的机制，并可通过激活caspase途径来完成肿瘤细胞凋亡过程，同时建立了槲皮素作为中药产生的抗肿瘤作用的检测和分析方法，在槲皮素诱导HeLa细胞发生凋亡机制及相关凋亡信号分子活化的研究领域，属国内、外首创。本项目已与浙江得恩德制药有限公司签订《槲皮素中药抗肿瘤制剂开发》项目合作意向书，下一步将进行小鼠体内荷瘤试验、槲皮素固体脂质纳米粒研究开发。
学术论文摘要
- 目的：研究槲皮素诱导HeLa细胞凋亡的作用，以及caspase-3、-8活化对凋亡的影响。方法：采用噻唑蓝（MTT）法观察槲皮素对HeLa细胞和L-02细胞的生长抑制作用；DAPI染色观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段化分析，荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡情况；比色法测定细胞凋亡过程中caspase-3、-8活性变化。结果：MTT结果显示，槲皮素可选择性抑制HeLa细胞的生长，并呈剂量、时间依赖性，而L-02细胞不出现生长抑制。160.0μmol•L-1槲皮素处理HeLa细胞72 h，DAPI染色见核浓缩及边缘现象，DNA电泳出现特征性凋亡条带。160.0μmol•L-1槲皮素处理HeLa细胞24h、48h和72h的凋亡率分别为（9.4±2.1）%、（30.1±6.5）%和（59.8±9.5）%，caspase-3活性在48h达最高（1.68±0.07）U•μg-1，而caspase-8活性则在24h达最高（1.83±0.06）U•μg-1，两者与对照组相比均有显著性差异。结论：槲皮素可特异性地诱导人HeLa细胞凋亡，其诱导凋亡机制可能与caspase-3、-8活化有关。
获奖情况
- 本作品于2011年4月《中国药学杂志》第46卷第8期上发表。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1. MENG D S, WANG S L. Antitumor effect of quercetin[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药), 2001, 32(2): 186-188. 2. ZHAI Y Y, ZHOU L, LAI Y H. Research of quercetin on Antitumor activit[J]. Journal of Modern Clinical Medical Bioengineering(现代临床医学生物工程学杂志),2005, 11(1): 18-20. 3. MEDIERO JM, ALONSO A, BORDA A, et al. Effect of polyphenols from the Mediterranan diet on proliferation and mediators of in vitro invasiveness of the MB-49 murine bladder cancer cell line[J].Actas Urol Esp, 2005, 29(8): 743-749. 4. CHEN W S, WANG X, ZHUANG J G, et al. Induction of death receptor 5 and suppression of survivin contribute to sensitization of TRAIL-induced cytotoxicity by quercetin in non-small cell lung cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(10): 2114 - 2121. 5. FAIY H, PSAHOULIA, KONSTANTINOS G, et al. Quercetin enhances TRAIL-mediated apoptosis in colon cancer cells by inducing the accumulation of death receptors in lipid rafts[J].Mol Cancer Ther, 2007, 6(9): 2591 - 2599.
同类课题研究水平概述
- 槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于植物界，山楂、洋葱等含量较高。槲皮素具有多种生物学活性，如扩张冠状动脉、降低毛细血管通透性和抗肿瘤等多种药理作用。已有研究发现，槲皮素不仅对多种致癌物、促癌物和致癌剂有拮抗作用，而且对多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用。如人卵巢癌细胞、多种胃癌细胞、结肠癌细胞等。据文献报道：槲皮素能抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，促机体正常细胞分化，诱导肿瘤细胞凋亡。 宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，每年全球死于宫颈癌的妇女有20万。并且，宫颈癌发病率逐年上升，使人们更深刻地认识到开发具有良好抗癌作用药物的重要性和紧迫性。槲皮素在我国资源十分丰富，成为具有抗肿瘤作用的药物也颇有希望。但目前对槲皮素的研究尚存不足：虽然多数研究证实槲皮素的抗肿瘤效果，但也有个别实验室得出槲皮素可能促进肿瘤发生、发展的结果，对某些信号分子的调控研究也不尽相同。因此，深入了解槲皮素对肿瘤细胞的抑制作用及其机制，对进一步开发新型具有抗肿瘤作用的中草药具有重要而深远的意义。 目前，槲皮素的抗肿瘤作用机制有以下可能：首先，槲皮素可以抑制原癌基因c-fos、c-jun和ras癌基因的表达，由于P21ras在ras-raf-MAPK 信号通路中起着重要作用，可在翻译水平上抑制突变型P53蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞停滞在G2-M 期，阻止新合成的P53蛋白聚集；其次，槲皮素可下调阻遏热休克蛋(heatshockpretein，HSP)的基因转录水平及HPV18 E7、P16 mRNA表达，诱导肿瘤细胞凋亡；也可能通过激活细胞内Ca2+信号传导通路，最终通过线粒体途径，诱导肿瘤细胞凋亡；此外，槲皮素还可增加转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)的表达，使肿瘤细胞分泌大量的TGFβ1，诱导肿瘤细胞凋亡，并参与了肿瘤细胞增生和分化的调节，且呈明显的剂量依赖性；再则，槲皮素还可减少肿瘤细胞DNA的复制，导致肿瘤细胞分裂的延迟，从而将肿瘤细胞阻滞于不同的细胞周期，如人的胃癌、结肠癌细胞的生长可被阻滞于G1/S的分界处，人白血病的T细胞可被阻滞于G1晚期，HL60、MCF-7细胞可被阻滞于G2/M 期，同时也可介导抑制PI3K-Akt/PKB途径等等。因此，深入了解槲皮素的抗肿瘤作用机制，必将进一步推动我国对中草药抗肿瘤活性研究的深入。
