基本信息
- 项目名称：
- 运用BALB/C小鼠肝癌逐级转移模型评价复方苦参注射液疗效
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 研究内容：建立建立BALB/C小鼠分级转移肝癌模型与复方苦参注射液疗效分析。通过筛选具有持续增殖能力的肿瘤干细胞。以transwell实验挑选具有迁移能力差异的细胞亚株。通过原位植入肝癌细胞的小鼠，进行体内转移能力的分离。原代分离及培养，肿瘤侵润原位肝癌组织、淋巴结、肺部转移灶、腹水。再次植入小鼠并重复4次，以达到分离转移分化的目的。最后选出最大差异的两亚株进行苦参注射液的疗效评价。
- 详细介绍：
- 工作方案： 1.从广州中医药大学肿瘤实验室获得BALB/C小鼠H22肝癌细胞系。在无菌条件下，快速解冻，一般培养基+小牛血清混合液稀释，并提取单细胞，数量为100个。 2.将10个肿瘤细胞放入同一培养管中。培养管经行固态培养基覆盖预处理。 3.待细胞增殖至形成“细胞群”时，分离挑取独立细胞群，再次培养增殖，直至细胞数量约2*10^7时，停止培养，细胞亚株标号。 3.1若集合癌细胞所生成的生长刺激因子浓度不够，目标细胞不增殖分裂，则将集合癌细胞快速生长期的培养液混合清洁小牛血清+培养基以1/2比例配成混合液，再培养细胞亚株。 4.保存细胞样品，MTT法计数，定量细胞为10^6/ml。 5.分离、过滤肿瘤细胞株，做transwell实验： 6.取出现迁移的次序为第一，最后的细胞亚株解冻，培养，分别标号为HL组。 7. 分离、过滤浓缩细胞至10^7/ml,备用。 8．普通级BALB/C小鼠表面，注射H22细胞亚株HL组于左肝叶，每组8只。 9.抗生素预防感染处理3天。 10．过程只观察毛色，食量，饮水量，活动等。 11.5周后杀鼠 11.1颈脱臼处死小鼠，泡入75%的酒精消毒，移入超净工作台。 11.2腹部剪开皮肤，并剥皮。 11.3取腹水、肝原位肿瘤、周围淋巴结（特别是肿大淋巴结）、肺组织。 11.4用等浓度分离法分离腹水细胞，抽取癌细胞，再培养，标号。 11.5取肿大淋巴结原代培养，标号。 11.6对肝原位肿瘤、周围淋巴结、肺，做石蜡切片，计数癌细胞侵润，分级。 11.6．1以《从基因组学到蛋白组学肝癌转移分子机理的研究及临床应用》中评级标准为参照标准。预实验1次以获得正确的杀鼠时间点。 12．取评级次序为第一，最后的细胞亚株再次种植到下一批次小鼠肝脏。（重复7-11步，重复3次）。共耗时约20周。共用鼠2组*每组4只*3批次=24只。 13.至最后一批次取评级次序为第一，最后的细胞亚株，分离原代培养腹水癌细胞，原代种植到第4批次小鼠（HL组*高中低*每组4只=48只），经过2周，造模结束。 14.从第4批次小鼠种植癌细胞的第2周开始给腹腔注射给药，连续注射21天。 15.杀鼠，取腹水、肝原位肿瘤、周围淋巴结（特别是肿大淋巴结）、肺、胸腺、脾组织。 16.对肝原位肿瘤、周围淋巴结、肺，做石蜡切片，计数癌细胞侵润，分级。腹水总癌细胞计数。 17.数据统计，分析。统计学方法数据用x ± s 表示, 采用SPSS11 .0 统计软件进行分析, 检验水准α= 0 . 05。 18.论文写作
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的 观察肿瘤在免疫压力下转移的分化，建立具有健全免疫的肿瘤分级转移模型，为进一步研究免疫压力在肿瘤细胞转移过程的分子演化中的作用奠定了基础。 基本思路 目前抗肿瘤的方法，除了手术切除，大部分治疗方式都有强烈的致畸作用，因此在抗肿瘤治疗的过程中会不断产生新的致癌因子，改变肿瘤的生物行为性质。因此基于健全免疫的分级转移模型，通过肿瘤转移的行为筛选合适的抗肿瘤药物，就能指导临床抗肿瘤药物的使用。
科学性、先进性及独特之处
- 本文选择具有健全免疫系统的BALB/C小鼠作为模型，其目的是为了观察在自然状态下肿瘤在免疫压力下的转移倾向，贴近临床实际。 本文以建立逐级转移非裸鼠肝癌转移模型为集成创新，并以此建立以转移分化差异的研究平台及药物试验平台，可为临床药物使用提出指导性意见。
应用价值和现实意义
- 建立肝癌同种异体移植，分级转移模型，建立以非裸鼠，且具有免疫力的体内逐级转移模型。为进一步研究免疫压力在肿瘤细胞转移过程的分子演化中的作用奠定了基础。指导临床的药物应用。 改变实验方法，其一，观察肿瘤细胞在同种小鼠免疫健全的状态下肿瘤侵润的趋势；其二，减少由手术应激引起的对小鼠机体对肿瘤细胞的免疫反应等的影响。 改良细胞培养增殖单细胞方法，降低实验成本，并达到增殖单个肿瘤细胞的目的。
学术论文摘要
- 无
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 【参考文献】 1. 汤钊猷 李雁 转移性人肝癌模型系统建立及肝癌转移研究应用 医学研究杂志 2007-10； 36 （10） 2. 万方军 蔡健华 赵任 体内连续筛选法建立人结肠癌肝转移阶梯细胞模型 《外科理论与实践》2009；14（6）：633-638 3. 杨敏 杨朝晖 侯致典 李学农 体内连续筛选法建立可视化乳腺癌肝转移裸鼠模型 《南方医科大学学报》2008；28（6）：944-947 4. 张玉侠 朱秀 王金萍 体内外连续筛选建立人前列腺癌高转移细胞亚系及其生物学特性《安徽医科大学学报》2009-4；44（2）：173-176 5. 脱朝伟 刘秋珍 张宁 杨波 王明耀 体内连续筛选法建立人原发性小肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型《解放军医学杂志》2007-9；32（9）：926-929 6. 李雁 汤钊猷 叶胜龙 刘银坤 陈洁 体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系《中华医学杂志》2002-5-10；82（9）：601-605 7. 汤钊猷 高转移人肝癌裸鼠模型和细胞系的建立、研究与应用医学研究通讯2003；32（9）：16-17 8. 韩克起, 顾伟 小鼠肝癌原位移植模型的建立及生物学特性 中西医结合学报2004 -9 ；2（5 ）： 372-374 9．张萌，胡少为，姜桔红，文剑明 梯度密度离心法分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立 2007-11；28（6）：670-671 10. 代志军 高洁 复方苦参注射液对胃癌SGC-7901细胞侵袭转移能力的影响 中药材2007-7；30（7）：815-819 11. 叶正青 梁重峰 复方苦参注射液对人肝癌SMMC-7721肿瘤细胞作用的实验研究 山东医药 2009； 49(16) ：44-45 12. 李芮 杜健鹏 侯仰韶 复方苦参注射液对SGC-7901,HepG2和BEL-7402肿瘤细胞作用的实验研究 肿瘤研究与临床 2006 ；18(1) ：8-10 13. 林丽珠 周岱翰 复方苦参注射液对肺癌和肝癌细胞抑瘤作用研究中药新药与临床药理2009-1； 20（1）：21-23
同类课题研究水平概述
- 同类研究： 一、模型的建立 目前这种体内连续筛选法建立肿瘤模型都是以裸鼠为实验模型，具有基因学的明显优势。该模型系统的裸鼠体内转移特点表明，随着特定器官转移筛选次数的增加，瘤细胞对该器官的定向转移能力逐渐增强，同时也出现了转移方向的泛化趋势，这是一个自发性转移力由弱到强、由单向转移到多向转移的动态模型系统，有非常明显的表型差异，有利于探索其背后的分子机制。【1】 已经建立的模型种类有人结肠癌肝转移【2】，可视化乳腺癌肝转移【3】，人前列腺癌高转移【4】，人原发性小肠淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型【5】，自发性肺转移人肝癌模型篇【6】。虽然裸鼠实验的在理论上具有的优势相当明显，但是实验条件比较高，需要无菌环境或SPF。 基础的理论方法是汤钊猷【6】最早提出，体内连续筛选法，并建立了LCI．D20【7】，MHCC97，MHCC97-L等不同的转移模型。 基础的实验方法参考韩克起【8】的实验数据，建立相关的统计数据，为本实验提供成本的相关信息。 实验所需的梯度密度离心法分离肝癌细胞是现实可行，容易操作的实验方法【9】。 二、复方苦参注射液的临床价值 复方苦参注射液在临床上已经使用了10年余，是临床上有效的抗肿瘤中成药物，是具有中医特色的治疗手段，为拒绝放化疗及手术治疗的患者提供治疗手段，学术文献以临床观察为主，证明了复方苦参注射液在抗肿瘤治疗上有广泛的抗癌谱，联合化疗治疗中晚期恶性肿瘤能减轻毒副反应、提高近期疗效和患者生存质量。 但是由于临床条件，苦参注射液的应用主要是以常规化疗为基础，以辅助用药的角色在临床上应用，未能体现出苦参注射液单药对肿瘤实体作用，因此单药临床药物研究的文献相对较少。 复方苦参注射液在细胞组织学方面的研究相对较少，但是也是复方苦参注射液单药对肿瘤细胞的作用研究相对集中的领域，现已证明了复方苦参注射液对胃癌SGC-7901【10】，人肝癌SMMC-7721【11】有促调亡和诱导细胞凋亡的作用。同时复方苦参注射液也对HepG2和BEL-7402【12】，肺癌LAC、Lewis细胞,肝癌Hep、H22肿瘤细胞均有体内、外的抑瘤效果【13】。 利用体内连续筛选法是一个较为新型的肿瘤模型，对肿瘤的病理发展具有理论的优势，明确了肿瘤转移的潜在能力，为抗肿瘤药物干预存在转移潜能差异的细胞提供一个平台。
