基本信息
- 项目名称：
- 人TSHβ新剪接变体重组蛋白的表达
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 通过对TSHα链和TSHβ新剪接变体的研究，有助于更加深入的了解下丘脑-垂体-甲状腺免疫系统网络。从一个新的角度来了解人类自身免疫性甲状腺疾病。研究空间及内分泌学意义较大。
- 详细介绍：
- 下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）是一个综合性调节荷尔蒙分泌的网络，对于维持代谢活动的必不可少的。TSH（促甲状腺激素）是垂体分泌的促进甲状腺的生长和机能的激素。近期发现在人的外周血白细胞、垂体和甲状腺中存在一个新的TSHβ剪接变体，其生物学作用目前尚不清楚，本实验通过对TSHβ新剪接变体基因和TSHα基因进行克隆，利用CHO细胞表达系统获取重组蛋白并进行鉴定，以便对TSHβ新剪接变体存在的生物学意义进行深入研究。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 将克隆得到人TSHβ新剪接变体基因，TSHα基因，利用CHO表达系统获得TSHβ新剪接变体基因蛋白和TSHα基因蛋白，并将尝试验证TSHβ新剪接变体与TSHα能否形成的二聚体。 利用RT-PCR方法，从人外周血白细胞和胎盘分别获得TSHβ新剪接变体基因和TSHα基因，采用质粒构建表达载体，经酶切和测序鉴定后，将重组表达载体转入CHO细胞，抗生素加压筛选，得到蛋白并进行鉴定。
科学性、先进性及独特之处
- 人类TSH为一种糖蛋白，含211个氨基酸，糖类约占整个分子的15％。整个分子由两条肽链—α链和β链组成。2009年Vincent等报告小鼠骨髓细胞表达一新TSHβ剪接变体，是由84个氨基酸组成的多肽。TSHβ新剪接变体基因在CHO细胞中表达的分泌蛋白，分子量为8kDa，初步检测有生物活性。课题新颖独特，属于下丘脑－垂体－甲状腺－免疫系统网络中的未知领域。研究空间及内分泌学意义较大。
应用价值和现实意义
- 通过对TSHɑ基因链和TSHβ新剪接变体的研究，有助于更加深入的了解下丘脑－垂体－甲状腺－免疫系统网络，对TSHɑ基因剪接体，TSHβ新剪接变体，及二者的结合体的生物学活性研究具有重要意义。 本课题的研究有助于了解及研究免疫系统细胞，T细胞,B细胞,脾树突状细胞,骨髓造血细胞,肠粘膜上皮细胞和淋巴细胞等对生成TSH的机制和功能意义，并从一个新的角度来了解人类自身免疫性甲状腺疾病。
学术论文摘要
- 目的：我们通过本实验将克隆得到人TSHβ新剪接变体基因，TSHα基因，利用CHO表达系统获得TSHβ新剪接变体基因蛋白和TSHα基因蛋白，并将尝试验证TSHβ新剪接变体与TSHɑ能否形成的二聚体。方法：利用RT-PCR方法，从人外周血白细胞和胎盘分别获得TSHβ新剪接变体基因和TSHα基因，采用质粒构建，成功构建表达载体 pSELECT-GFP zeo-TSHβ和pcDNATM3.1D/V5-His-TOPO；经酶切和测序鉴定后，将重组表达载体转入CHO细胞，抗生素加压筛选，得到蛋白并进行鉴定。结果：得到了人TSHβ新剪接变体基因和TSHα基因，测序结果正确；成功构建了表达载体并得到稳定表达TSHβ新剪接变体蛋白和TSHα基因蛋白的CHO 细胞株， 利用TSHβ抗体与TSHα抗体进行Western Blot检测，结果显示人TSHβ新剪接变体蛋白约为8KDa，TSHα成熟蛋白约为20 KDa。结论：成功克隆TSHβ新剪接变体基因和TSHα基因，获得TSHβ新剪接变体和TSHα的重组蛋白，为深入研究TSHβ新剪接变体生物学特性提供了必要条件。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]JOHN R. KLEIN, et al. The Immune System as a Regulator of Thyroid Hormone Activity[J]. Department of Diagnostic Sciences, Dental Branch, University of Texas Health Science Center, Houston, TX 77030 [2]Jeremy S, Schaeferand John R, Klein, et al. Immunological regulation of metabolism- a novel Quintessential role for the immune system in health and disease[J]. The FASEB Journal. 2011, 25: 29-34.
同类课题研究水平概述
- 早在几十年前人们已经认识到神经内分泌系统能直接和间接地影响免疫系统的发育和功能的活性。 人类和小鼠TSHβ亚单位由138 氨基酸组成，含有20个氨基酸组成的信号肽，成熟甲状腺激素β亚单位蛋白为118个氨基酸。人TSHβ基因由3个外显子和2个内含子组成，编码区由位于外显子2和3的部分组成。小鼠的TSHβ基因由5个外显子组成，编码区由位于外显子4和5的部分组成。从人垂体分离的hTSHβ只有112个氨基酸，是由于C端的6个氨基酸被去掉所致。α亚单位的生成与分泌总比β亚单位多，所以α亚单位与β亚单位结合成TSH后，血中一般测不出残留的β亚单位，但可以测得α亚单位[1]。 20年前Smith等人首次证实了免疫系统细胞可以产生TSH，随后相继发现T细胞，B细胞，脾树突状细胞，骨髓造血细胞，肠粘膜上皮细胞和淋巴细胞都可以产生TSH。在次级淋巴组织，脾树突状细胞(DCs)是TSH的重要来源[2]。但到目前为止这些细胞生成TSH的机制和功能意义还不十分清楚。 最近的研究表明，目前免疫系统中的TSH，存在着一种TSHβ新剪接变体。这种剪接变异体优先由免疫系统细胞生成，并通过一些造血细胞迁移至甲状腺[3]。 2009年Vincent等报告小鼠骨髓细胞表达一TSHβ新剪接变体，是由84个氨基酸组成的多肽，含有9个氨基酸组成的信号肽，有意思的是它只是原始的成熟的TSHβ分子的71.2%[4]。TSHβ新剪接变体是由TSHβ基因第4内含子的一部分和第5外显子编码而成，缺失外显子4。自然的TSHβ在垂体中高表达[5]，而TSHβ新剪接变体在骨髓和甲状腺中高表达，在垂体中表达较低。TSHβ新剪接体基因在CHO细胞中表达的分泌蛋白，分子量为8kDa，初步检测有生物活性。TSHβ新剪接变体在FRTL-5甲状腺滤泡细胞和鼠的肺巨噬细胞引起cAMP反应，TSHβ诱导cAMP反应的峰活性浓度是10-10mol, TSHβ新剪接变体诱导cAMP反应的峰活性浓度是 10-6mol。在系统性病毒感染以后，TSHβ新剪接变体在甲状腺中的表达显著上调而自然的TSHβ在甲状腺中并没有显著上调[6]。推测这个新发现的TSHβ新剪接变体可能在下丘脑-垂体-甲状腺-免疫系统网络中起重要作用。
