基本信息
- 项目名称：
- 桑树枯萎新病原细菌快速准确检测技术
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 根据RNA聚合酶的rpoB处基因，设计引物，利用常规PCR及RT-PCR的方法非常简单快速检测引起桑树枯萎的细菌Enterobacter mori 。特定性多种桑树的附生植物细菌所检测过，均100%有效。该检测手段的灵敏性，利用实时PCR检测能可靠地察觉到至少10fg/ul的DNA的来自桑树根茎的细菌细胞的悬浮液。
- 详细介绍：
- Enterobacter mori 是一种引起桑树细菌性枯萎的细菌，它正在成为一种威胁中国桑树园的病害。由于目前还没发现一种有效的控制策略，对桑树潜在感染进行可靠的检测就显得很必要了。因此本研究中，我们建立起一种快速的PCR检测技术，用来检测E. mori。根据RNA聚合酶的rpoB处基因，我们设计好引物，利用常规PCR及RT-PCR的方法非常简单快速，而且特定性已经被4个代表E. mori的菌株，9个肠杆菌菌株，2个其他主要桑树病原菌菌株，7个其他植物联合病原菌菌株和50种未经确认由桑树立体培养的附生植物细菌所检测过，均为100%有效。该检测手段的灵敏性上，利用实时PCR检测能可靠地察觉到至少10fg/ul的DNA和102 CFU/ml 的来自桑树根茎的细菌细胞的悬浮液，为所有有明显症状和部分潜在感染的植物病害测试产生的强阳性反应提供了证据，证明这种方法对于桑树中潜在的E. mori感染进行筛选是可靠，灵敏的。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 近年浙江、广西两省桑蚕产区发现一种新的病原菌E.mori ，导致大面积桑叶枯萎，造成蚕桑业重大损失。传统的检测程序繁杂，耗时长，常常延误了防治。这一套快速准确的检测方法，可直接检测取自田间病树根茎样本的细菌悬浮液，基本上可达到只要有一个活的细菌就能有效的检测出来的效果，可避免病菌的纯化培养及其DNA的检测鉴定等复杂程序。从而在保证灵敏准确的同时，大大缩短检测时间，为农业防治和对症下药提供基础。
科学性、先进性及独特之处
- 桑树的枯萎细菌Enterobacter morus是2009年由实验室首先发现并报道的，具有独立的知识产权；本项目中PCR检测技术的核心在于引物，而此种引物是我们基于Enterobacter morus RNA聚合酶的rpoB处的基因序列独立设计出来并经过检验具有特异性和灵敏性的。
应用价值和现实意义
- 桑树枯萎病菌的灵敏快速的PCR检测方法一旦应用到实际农业生产中，可以在发病初期就及时确定是否是该病菌所导致，从而帮助采取措施对症下药，帮助农民减少桑枯萎所带来的巨大经济和物力损失，帮助提高蚕桑业产品质量，为蚕桑的健康发展提供保障。
学术论文摘要
- Enterobacter mori 是一种引起桑树细菌性枯萎的细菌，它正在成为一种威胁中国桑树园的病害。由于目前还没发现一种有效的控制策略，对桑树潜在感染进行可靠的检测就显得很必要了。因此本研究中，我们建立起一种快速的PCR检测技术，用来检测E. mori。根据RNA聚合酶的rpoB处基因，我们设计好引物，利用常规PCR及RT-PCR的方法非常简单快速，而且特定性已经被4个代表E. mori的菌株，9个肠杆菌菌株，2个其他主要桑树病原菌菌株，7个其他植物联合病原菌菌株和50种未经确认由桑树立体培养的附生植物细菌所检测过，均为100%有效。该检测手段的灵敏性上，利用实时PCR检测能可靠地察觉到至少10fg/ul的DNA和102 CFU/ml 的来自桑树根茎的细菌细胞的悬浮液，为所有有明显症状和部分潜在感染的植物病害测试产生的强阳性反应提供了证据，证明这种方法对于桑树中潜在的E. mori感染进行筛选是可靠，灵敏的。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 该项目是由学生独立设计完成的，方法简便快速，具有非常实际的应用价值。
参考文献
- 1. Adékambi, T., Drancourt, M., and Raoult, D. 2009. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17:37-45. 2. Baumgartner, A., Grand, M., Liniger, M., and Iversen, C. 2009. Detection andfrequency of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) in different categories of ready-to-eat foods other than infant formula. Int. J. Food Microbiol.136:189-192. 3. Chow, J. W., Fine, M. J., Shlaes, D. M., Quinn, J. P., Hooper, D. C., Johnson,10 M. P., Ramphal, R., Wagener, M. M., Miyashiro, D. K., and Yu, V. L. 1991.11 Enterobacter bacteremia - clinical-features and emergence of antibiotic-resistance during therapy. Ann. Intern. Med. 115:585-590. 4. Haas, C. N. 1989. Estimation of microbial densities from dilution count experiments. Appl. Environ. Microbiol. 55:1934-1942.
同类课题研究水平概述
- 桑树（Morus alba Linn.）是一种多年生的木本植物, 其不仅是家蚕唯一的食物来源是, 同时也是中国蚕农的主要经济支柱。因此，桑树的一些流行病害也受到广泛关注。到目前为止，世界上已经报道的桑树病害有400 多种，国内发现有100 多种，其中真菌病害88 种，病毒病害10 种，线虫病害6 种，生理病害4 种，细菌病害5 种和植原体病害2 种 (蒯元璋 2000; 胡兴明, 叶伟彬, 叶楚华 2004; 夏志松 2005)。 到2009为止，国内外报道的桑树细菌病害有8种，分属于植物细菌中的6个属(Erwinia, Ralstonia, Pseudomonas, Phytoplasm, Xanthomonas及Xylella) (蒯元璋 2000; Hernandez-Martinez et al. 2006; Banerjee et al. 2009)。然而，实验室仔细观察后发现上述不少桑树“枯萎”病株，其发病症状不同于国内外当时报道的细菌病害，虽说该病的一些症状特征类似于桑青枯病，但显著的差别是该病一般始于桑树下部叶片，幼桑上尤为明显，病叶枯萎后由下而上脱落，造成光杆。准确诊断病原是有效治理新病害的关键, 为明确这一严重的桑“枯萎”病究竟由哪种微生物引起, 实验室对该病的病原作了深入的研究，最终定义了这个新种。 由于初步实验表明常用的田间农药对于该病没有良好的防治效果，而且一些证据显示该病是土传病害，因此我们认为对于该病的防控，首先最主要的一点是从源头上切断病原的来源，即种苗的带毒。欲从带菌量很低的外形健康的种苗上快速检测到桑细菌性枯萎病的存在，必须借助PCR分子检测技术，鉴于目前对肠杆菌类细菌的分子检测技术尚停留在人体和动物致病菌上，因此通过使用引物探索对木本植物样本材料的PCR检测技术十分必要。
