基本信息
- 项目名称：
- 神经胶质细胞引导脑血管发育的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本实验利用凝胶墨汁标记血管，Nestin标记放射状细胞，GFAP标记成熟星型胶质细胞，再用激光共聚焦荧光显微镜观察脑片。发现在小鼠脑发育早期，小血管生长方向与放射状胶质细胞长突起延伸方向一致；中期及成熟期，大量来源于放射状胶质细胞的星型胶质细胞伸出膨大的足板参与血脑屏障的构筑，以上表明神经胶质细胞的确在CNS血管发育中起指导作用，同时对理解脑血管瘤的发生有积极作用。
- 详细介绍：
- 神经胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量最多的一类细胞，最早人们认为它们仅仅起支持和营养作用，而随后大量研究表明它们在CNS的生长﹑发育﹑工作和修复等活动中扮演着更加重要的角色。在前人已取得的成果基础上，我们采用免疫组织化学和凝胶墨汁灌注的方法，针对皮质区发育中神经胶质细胞分化和血管发育的关系进行探究，希望找出神经胶质细胞在血管发育中的地位，为今后进一步的工作做铺垫，同时，完善脑发育中血管发育的理论，并为临床提供一些有益的指导。 神经系统和循环系统在结构上有诸多相似性，在发育上也有许多协同性，一些轴突引导分子，如成形素、生长因子、血管生成因子等对神经系统和循环系统的发育有双重作用[37]，所以，二者之一发生异常都会导致如Alzheimer’s diease(AD)、amyotrophic lateral sclerosis(ALS) 等神经退行性疾病[38]。对神经血管发育关系及其机制的研究有利于我们了解这些疾病的发病原理，找到对策，从而给疾病的治疗提供指导，具有十分重要的意义。 实验按照： 凝胶墨汁灌注与取材→免疫组织化学染色→图像采集的步骤进行 首先选取C57BL/6J成年健康小鼠，常年在相对湿度60％～70％、室温在22～25 ℃环境下饲养。定期消毒，房间面积60 m²。按自然昼夜节律采光，自由进食和饮水。小鼠饮用水选用实验室自制单蒸水，并定期更换垫料、消毒。实验中将雌雄鼠于18：00时以2：1合笼，次日8：00前查栓，发现母鼠阴道栓塞之日计为受孕0天（Embryonic，E0）定为妊娠的开始，仔鼠出生当日计为生后当天（postnatal day 0，P0）。选取E15、E17、P0、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、P12、P14、P16、P18、P20、P25、P30、P60小鼠。 然后进行免疫组织化学染色：从切片上剥离琼脂糖，脑片放在六孔板中并以0.1M PB液漂洗3次×5min，然后转移到24孔板中，每孔加5-6片。 每孔加入100-200μL一抗混合溶液（Nestin: 1: 200; GFAP: 1: 80），置于4℃冰箱中孵育48h。移除一抗，加入PB液，将脑片转移到六孔板中，加PB液漂洗3次×5min，再次转移到新的24孔板，避光条件下加入100-200μL二抗（山羊抗鼠（488）：1: 100；山羊抗兔（568）：1: 100）混合溶液，常温下于振荡摇床上孵育8h。 移除二抗，加入PB液，切片转移到六孔板中用0.1M PB液漂洗3次×5min。 用65%甘油和指甲油封片。 阴性对照，以等量PB液代替一抗混合液，其他步骤不变。 上述步骤完成后进行图像采集（本实验采用FLUOVIEW FV1000激光共聚焦荧光显微镜 日本奥林巴斯公司 ） 正常开机后，设置激光共聚焦显微镜的step size为1- 2μm，扫描5- 11层，肉眼下用低倍镜在脑片皮质区上选择适合的区域，然后转入高倍镜自动扫描，三个波段同时进行。所获得的图片利用FV10-ASW 1.6 Viewer软件处理以达到最理想效果。 通过观察分析可知:发育早期，小鼠大脑皮质区域存在大量Nestin阳性细胞，胞体位于脑室区，它们的长突起由胞体向外延伸，呈放射状平行排列，在小血管周围大量分布；相同区域的GFAP阳性细胞数量较少，主要在大血管周围分布。随时间增长，Nestin阳性细胞的数量越来越少，相反，GFAP阳性细胞的数量在增长。至成熟期（P14），Nestin阳性细胞只在部分小血管周围残留，GFAP阳性细胞伸出的突起末端膨大形成足板，在血管附近分布，参与血脑屏障的构成。 整个过程中，血管有两个特征：第一，小血管延伸方向始终与Nestin阳性细胞长突起延伸方向相同，并随突起方向变化而变化。第二，GFAP阳性细胞在成熟大血管周围分布，且数量随年龄增加而变多，随血管变粗足板数量也增加，分布更加密集。血管的发育过程与放射状胶质细胞的分化过程一致，这些显示二者间存在某种关系，总体的实验证据表明放射状胶质细胞引导血管发育。 根据形态学实验提供的直观结果我们可以说神经胶质细胞在血管发育中有引导作用，即神经胶质细胞可提供血管发育的模板，至于它们发挥作用的具体方式和分子机制还难以详细说明。但是通过本实验的研究，有利于我们了解脑血管肌瘤，进一步控制脑血管畸形的产生，对临床上治疗脑血管畸形有很大价值。
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撰写目的和基本思路
- 目的：对中枢神经系统中神经胶质细胞分化和脑血管发育的关系进行研究，找出神经胶质细胞在血管发育中的作用，同时完善脑发育中血管发育的理论，并对脑血管畸形的研究有一定的指导作用。 思路：本实验利用凝胶墨汁标记血管，Nestin标记放射状胶质细胞，GFAP标记成熟星形胶质细胞，再用激光共聚焦荧光显微镜观察大脑皮质中神经胶质细胞分化与脑血管发育的关系
科学性、先进性及独特之处
- 本实验的先进性与独特性在于利用凝胶墨汁标记血管，该方法为形态学观察提供了直观且有力的证据，这些证据是内在分子机制的外在表现。同时该实验利用Nestin标记放射状胶质细胞，GFAP标记成熟星形胶质细胞，再用激光共聚焦荧光显微镜观察脑片等先进技术也都体现出了作品的科学性。
应用价值和现实意义
- 本实验一方面丰富了血管发育神经生物学领域的研究，同时对医学神经胶质瘤的研究具有一定的指导作用。研究表明神经胶质细胞在支持、营养血管的发生，参与血脑屏障方面有一定的作用。通过本实验的研究，我们发现神经胶质细胞在引导血管发育过程中发挥了关键性的指导作用。进而对理解脑血管瘤的发生有积极作用，对脑血管畸形在临床治疗上很有价值。
学术论文摘要
- 神经胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量最多的一类细胞，最早人们认为它们仅仅起支持和营养作用，而随后大量研究表明它们在CNS的生长﹑发育﹑工作和修复等活动中扮演着更加重要的角色。前人在视网膜上完成的大量实验证据表明在血管发育过程中，神经胶质细胞发挥了关键性的指导作用，在CNS发育中也可能拥有相同的地位。本实验利用凝胶墨汁标记血管，Nestin标记放射状胶质细胞，GFAP标记成熟星形胶质细胞，再用激光共聚焦荧光显微镜观察脑片。发现在小鼠脑发育早期，小血管生长方向与放射状胶质细胞长突起延伸方向一致；中期及成熟期，大量来源于放射状胶质细胞的星形胶质细胞伸出膨大的足板参与血脑屏障的构筑，这些表明神经胶质细胞的确在CNS血管发育中起到指导作用。 目前已知的研究表明在中枢神经系统中神经胶质细胞在支持、营养血管的发生，参与血脑屏障方面有一定的作用。但是通过本实验的研究，我们发现神经胶质细胞在引导血管发育过程中发挥了关键性的指导作用，进而对理解脑血管瘤的发生有积极作用，对脑血管畸形在临床治疗上很有价值。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 王亮，梁英锐, 唐外星等. 人胚胎毛细血管形态发育—超微结构及图像分析仪定量研究.解剖学报, 1991, 22(4)：430- 433. [2] Abner Louissaint, Jr, Sudha Rao, Caroline Leventhal, Steven A Goldman. Coordinated Interaction of Neurogenesis and Angiogenesis in the Adult Songbird Brain. Cell, 2002, 34: 945- 960. [3] Burnstock G. Ralevic V. New insights into the local regulation of blood flow by perivascular nerves and endothelium. Br. J. Plast. Surg, 1994 , 47：527– 543. [4] Black JE, Polinsky M. Progressive failture of cerebral angiogenesis suporting neura plasticity in ageing rats. Neurobiol Ageing, 1989, 10(4) ：353- 358. [5] Doris D Wang, Angelique Bordey. The astrocyte odyssey. Progress in Neurobiology, 2008, 86, 342 - 367. [6] Evanko DS，Zhang Q，Zorec R。et a1．Defining pathways of loss and secretion of chemical messengers from astrocytes．Glia，2004，47(3)：233—240．
同类课题研究水平概述
- 目前已知的研究表明在中枢神经系统中神经胶质细胞在支持、营养血管的发生，参与血脑屏障方面有一定的作用。但是通过本实验的研究，我们发现神经胶质细胞在引导血管发育过程中发挥了关键性的指导作用，进而对理解脑血管瘤的发生有积极作用，对脑血管畸形在临床治疗上很有价值。 脑血管畸形是脑血管先天性、非肿瘤性发育异常。是指脑血管发育障碍而引起的脑局部血管数量和结构异常，并对正常脑血流产生影响。其破裂出血主要表现为脑内出血或血肿，其多见于年轻人，得到确诊年龄平均20－40岁。已知的研究发现神经胶质细胞对血管的支持，营养起到一定的作用，同时参与脑血屏障。通过本实验的研究，发现神经胶质细胞对血管的发生起到关键性的指导作用，进一步对脑血管瘤的发生产生了积极的作用，有利于我们更好的控制脑血管畸形的发生以及治疗。 神经胶质细胞是脑的主要组成成分，约占中枢神经系统（CNS）细胞总数的90%。神经胶质细胞没有尼氏体，表面与神经细胞一样有许多突起，但没有树突和轴突之分。胞间不能形成突触联系，胞膜上有随胞外K+浓度变化而产生的电位差，却不会形成动作电位也不能传递神经冲动。 放射状胶质细胞（RGC）最早出现在E9/E10期，来源于神经上皮细胞,是脑发育早期存在的一类细胞,成熟CNS中少见。RGC呈放射状，胞体卵圆形，有细长无分支的突起，呈apical-basal双级突起形态,有明显的细胞极性，是神经胶质细胞一种，有部分星形胶质细胞的性质。 星形胶质细胞（astrocyte，AST）是CNS中含量最多，体积最大的一类胶质细胞。在形态、受体分布、胞质活性物含量等方面,不同的AST之间存在明显的异质性。另外，不同脑区的AST会通过缝隙连接形成三维的胶质网络。 成熟星形胶质细胞的足板覆盖着绝大部分大脑血管的表面，是血脑屏障（ blood brain barrier BBB）的三种细胞组分之一,但是AST在哺乳动物的脑内不被认为具有屏障作用，而是对诱导和维持BBB起到关键作用。 查阅目前有关文献，尚未发现有类似的神经胶质细胞分化与脑血管发生方面的发育神经生物学资料与报道，该作品补充了这一领域的空白，有一定的理论与临床价值。
