基本信息
- 项目名称：
- 类牛源抗菌肽NK-16多重原核表达及活性检测
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列为模板，设计出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根据氨基酸序列和E.coli偏爱密码子，反向翻译设计并合成四段碱基序列。利用Overlapping PCR技术，获得三串联目的基因并成功克隆入pET 30a(+)载体中。经ITPG诱导获得大量表达，目的蛋白纯化酶切后仍具有抗菌活性。
- 详细介绍：
- 本试验在Indolicidin的氨基酸序列基础上，进行了蛋白酶切位点的筛选，重新设计新的抗菌肽NK-16人工合成经鉴定仍具有抗菌活性。根据NK-16的氨基酸序列选用大肠杆菌的偏好密码子，通过反向翻译设计合成了四段NK-16的基因片段，利用Overlapping-PCR技术，获得了目的基因片段。双酶切后成功克隆到表达载体pET-30a(+)，经ITPG诱导得到目的蛋白，纯化蛋白蛋酶切后获得具有抗菌活性的目的多肽。为抗菌肽的原核低成本、高效表达奠定了基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：通过基因工程手段大量获得抗菌肽 思路：首先筛选出抗菌活性高、抗菌谱广、分子量较小的抗菌肽，根据偏好密码子，人工设计所需要的基因片段，然后构建表达载体，最后诱导表达纯化，通过生物学手段鉴定出表达抗菌肽的抗菌活和抗谱。从而获得具有活性的表达抗菌肽。
科学性、先进性及独特之处
- 本文根据NCBI中的报道序列，人工设计合成新的抗菌肽NK-16基因，利用Over-laping PCR技术，获得三段NK-16的重复基因序列。这种方法使抗菌肽通过蛋白酶切位点连接起来避免了抗菌肽本身对大肠杆菌的抑制和杀灭作用，同时可增加多肽的表达量，从而可降低试验和生产成本。构建了NK-16基因的重组表达载体，转化至大肠杆菌获得了高效的表达，表达产物经纯化酶切后仍具有抗菌活性。
应用价值和现实意义
- 作品通过基因工程技术在微生物中直接表达抗菌肽，由于抗菌肽分子小，而且表达产物可能对宿主有害，进而影响了基因的高水平表达。本论文解决了在抗菌肽生产过程中效率低、成本高等亟待解决的问题。
学术论文摘要
- 抗菌肽与传统抗生素相比其抗菌性具有很大优越性，特别的抗菌肽不产生耐药性。但抗菌肽的来源一直是进行药理研究和推广应用难以突破的瓶颈。由于抗菌肽的分子小、含量低，直接从生物组织中提取、分离提纯存在一定的困难。而化学合成成本高不易推广应用。基因工程就成为获得抗菌肽的主要手段。本文以牛的抗菌肽（Indolicidin）序列为模板，设计出具有抗菌活性新型抗菌肽NK-16。根据氨基酸序列和E.coli偏爱密码子，反向翻译设计并合成四段碱基序列。利用Overlapping PCR技术，获得三串联目的基因并成功克隆入pET 30a(+)载体中。经ITPG诱导获得大量表达，目的蛋白纯化酶切后仍具有抗菌活性，为抗菌肽的原核高效表达和进一步生产大量的抗菌肽样品奠定了基础。
获奖情况
- 付登峰, 胡建和, 刘兴友. 抗菌肽基因工程表达技术研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(9): 124-126. Jianhe Hu, Minglu Xu, Bolin Hang, Lan Wang, Qing Wang, Junjie Chen, Tao Song, Dengfeng Fu, Ziliang Wang, Sanhu Wang, Xingyou Liu. Isolation and characterization of an antimicrobial peptide from bovine hemoglobin a-subunit.[J] World J Microbiol Biotechnol, 2011(27): 767–771. 付登峰, 胡建和, 刘兴友. 动物源性抗菌肽抗菌机理的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010(5): 24-26
鉴定结果
- 情况属实
参考文献
- 进行抗菌肽研究的表达体系包括真核和原核表达体系两种，其中在原核表达体系中大肠杆菌表达体系用的最多具有代表性，真核表达体系有小球藻表达体系、杆状病毒介导的昆虫表达系统、酵母表达体系，其中酵母表达体系用的最多可以说是真核表达体系的代表。 在过去的20年里，人们对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方面有了充分的认识，使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达系统。大肠杆菌遗传图谱明确、易培养、周期短、费用低，对许多蛋白质有较强的耐受能力，能较高水平地表达多种蛋白质。所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术的主要宿主细菌。
同类课题研究水平概述
- 进行抗菌肽研究的表达体系包括真核和原核表达体系两种，其中在原核表达体系中大肠杆菌表达体系用的最多具有代表性，真核表达体系有小球藻表达体系、杆状病毒介导的昆虫表达系统、酵母表达体系，其中酵母表达体系用的最多可以说是真核表达体系的代表。 在过去的20年里，人们对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方面有了充分的认识，使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达系统。大肠杆菌遗传图谱明确、易培养、周期短、费用低，对许多蛋白质有较强的耐受能力，能较高水平地表达多种蛋白质。所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术的主要宿主细菌。李秀兰等对天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改动，根据E.coli偏爱的密码子人工合成了肽基因片段，克隆到测序载体，再将此片段亚克隆至表达载体pET28上进行表达，融合蛋白经溴化氰裂解法（CNBr）裂解后，具有与天然抗菌肽相同的生物活性。2004年浙江大学的Peng等将人β-防御素2(hBD2)的基因插入到pET-32a(+)中构建融合表达载体，以大肠杆菌BL21为工程菌进行表达，纯化后的蛋白具有抗菌活性，该研究表明应用基因工程技术可以大规模制备抗菌肽。Rao等采用串联表达的方式在大肠杆菌中表达hPAB-β取得成功，在1～8个不同重复序列的串联表达体系中，3个重复序列时蛋白产量最高，达到菌体总蛋白的27.8%，相当于(3.15±0.45)g/L湿菌。为了获得大量fetidin，赵晓瑜等从蚯蚓(Eisenia fetida)中钓取fetidin的基因，分别克隆到pKW32和pMXB10中，构建了融合和非融合表达载体，并转化大肠杆菌进行诱导表达。结果无论是融合还是非融合表达，产物均以包涵体形式存在。融合表达产物通过亲和层析获得复性，复性产物对粘质沙雷氏菌具有抗菌活性。说明有些抗菌肽在进行融合表达时，不影响抗菌肽的抗菌活性。为了验证重组抗菌肽Ranalexin的抑菌活性，谢芳等提取牛蛙皮肤组织总RNA，经RT-PCR扩增抗菌肽基因ranalexin，克隆测序后，将该基因插入pGEX23X融合表达载体，进行原核表达，表达产物经复性纯化后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性。综合以上研究表明，原核表达是目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研究的主要方式。
