基本信息
- 项目名称：
- 蝴蝶兰miR172的克隆与功能验证
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 很多miRNA在植物的成花过程中，对很多重要转录因子的转录后或者翻译水平起调控作用，使植物开花时间的控制更加精细和复杂。其中最引人注意的是miR172，它的靶基因是AP2，在拟南芥中过量表达miR172会造成植物开花显著提前，而过量表达其靶基因AP2会造成开花延迟。目前对植物miR172的研究仅在拟南芥、水稻等模式生物或者重要农作物中研究得比较深入，在园林观赏植物中却未见报道。
- 详细介绍：
- 蝴蝶兰是兰科植物中最重要的一个属，也是在分子生物学领域研究比较多的一种兰科植物。研究参与蝴蝶兰成花调控的miRNA对植物miRNA调控机理是一种补充。蝴蝶兰是一种重要的经济花卉，具有很好的经济效益。但是蝴蝶兰开花前营养生长时间很长，一般为2年，且其成花要求的条件很严格，无法实现周年开花。目前主要催花的方法是通过春化作用，低温诱导开花。但是低温催花的耗电量大，增加了培养成本，而且能源的过量消耗不符合可持续发展的战略要求。同时，低温催花需要很好的密闭环境，容易滋生灰霉菌等真菌病害，降低了经济效益。 由此可见蝴蝶兰成花途径相关的miR172研究和进一步应用有助于低成本的实现蝴蝶兰提前开花，具有很强的实践意义。
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撰写目的和基本思路
- 1 对蝴蝶兰全基因组进行特异性扩增，获得两个miRNA172片段； 2 对上述新miRNA172测序，与已知的miRNA172做进化分析和二级结构预测； 3 设计原位杂交探针和半定量RT-PCR检测上述两个转录本和靶基因TOE1在蝴蝶兰组织中的表达情况； 4 将新miRNA172转基因到拟南芥中，统计T3代开花时间并观察表型。
科学性、先进性及独特之处
- miRNA是近几年的转录调控的研究热点之一，其作用机理的研究无论在疾病治疗还是遗传育种中都会具有十分广阔的应用前景和科学意义。本研究首次以观赏植物为材料，对开花调控miR172的作用机理进行研究，具有一定的创新性。因为蝴蝶兰相对拟南芥来说，分子生物学操作更加复杂，小分子RNA的研究更是首次。本研究的另一个目的是能够创建蝴蝶兰小分子miRNA的操作平台，为研究其它蝴蝶兰miRNA提供基础。
应用价值和现实意义
- 兰科植物包含很多重要的经济花卉，但因其开花周期长，人工催花的成本高，使市场价格提高。目前有基因工程方法转化开花调控基因，但因调控途径非常复杂，单个基因的表达变化，往往引起正、负调控共同作用，收效甚微，且可能对营养生长造成不良影响。本研究将转录因子上游起调控作用的microRNA进行转基因和育种，有望在不对其它表型产生明显改变的情况下促进开花。稳定遗传的转基因花卉也不存在安全问题，利于推广应用。
学术论文摘要
- miR172属于microRNA，在植物花发育中被证明扮演重要角色，通过抑制靶基因——AP2转录因子家族的mRNA下调其蛋白质的表达，从而解除其于正常花器官形成中的压力。基于本实验室已有的蝴蝶兰cDNA样本，通过比对已知其它物种中的同源miR172序列设计引物，获得两种不同长度的蝴蝶兰miRNA172-like转录本，分别为100bp和250bp，并通过在蝴蝶兰组织中进行原位表达、半定量PCR、测序分析和转基因模式生物对该miR172进行了功能验证。新发现的PhmiR172具有促进提前开花的功能，与已知的miR172基因具有极高的相似性，可以用于早花蝴蝶兰株系的培育，并为进一步理解兰科植物的成花机制提供理论基础。
获奖情况
- 1 专利申请一项： 专利申请号：20111006055.8 专利名称：蝴蝶兰miR172的克隆与功能验证 专利发明人：严钦骅，明凤，韩颖颖。 2 第一作者撰写SCI论文一篇：蝴蝶兰miR172的克隆与功能验证，已完成初稿。
鉴定结果
- 专利申请号：20111006055.8，状态：正在审查中。
参考文献
- 1 Cell, 2004, 116: 281–297. 2 The Plant Cell, 2007, 19: 2736–2748. 3 The Plant Cell, 2003, 15: 2730–2741. 4 BMC Plant Biology, 2009, 9:149. 5 Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (2):487-495. 6 The Plant Journal, 2007, 51: 840-849. 7 Developmental Biology, 2006, 295: 324 –326. 8 PNAS, 2005, 102(26): 9412-9417. 9 Plant.Mol. Biol, 2006, 61:781–793 10 Mol.Biol.Evol., 2006, 23(1):107–120.
同类课题研究水平概述
- miRNA作为非编码序列广泛存在于各物种的基因组中，但近十年才为人所关注。成熟的miRNA是一类长度很短的单链小分子RNA，约20-24 nt，由一段具有发夹环结构的、长度为70-80 nt 的单链RNA 前体(pre-miRNA)剪切后生成；与Argonaute (Ago)蛋白结合形成RISC（RNA- induced silencing complex），通过与靶mRNA的互补识别，介导RISC将其降解，从而下调靶基因的表达。功能上，它们参与转录水平的表达调控，在多种模式生物的发育过程，例如细胞分化、分裂、生长、衰老、凋亡等调控途径中表现出至关重要的地位。 目前人们对microRNA的了解并不深入，研究手段也有限。作为新发现的转录后水平调控因子，miRNA被证明在各类生物基因组中潜在的大量未知microRNA在遗传调控担当了十分重要的角色，且在同类生物中往往具有很高的同源性，尽管如此，关于miRNA的探索依然具有十分广阔的研究空间和应用价值。因此目前的研究致力于一边不断寻找新的miRNA基因，并对已知miRNA通过克隆和分子探针实验来确定其在组织调控中的作用；一边不断探索miRNA作用的分子作用机制和靶基因。生物信息学的发展使得我们能够快速从基因组序列中搜索并推测新的miRNA以及其靶基因序列，但用这种方法存在一定的弃真或纳伪风险，依然需要大量的分子克隆验证新基因的功能。 本研究对象miR172在植物中具有高度的保守性。已知它在拟南芥、水稻、烟草、玉米等五种中的同源基因，通过与靶基因AP2转录因子家族的mRNA互补结合将其识别，介导RISC将其降解。由于AP2家族基因的成员众多，miR172也占据了与营养-生殖发育转变相关的调控网络的相当中心的地位。在花器官内轮，miR172抑制AP2的过高表达，防止其诱导内轮花器官转变为花被并无限增殖；在玉米中，miR172在顶端分生组织中下调glossy15(AP2-like)促进营养生长结束进入开花准备阶段；此外，miR172还独立于CO参与了GI介导的光周期开花调控途径。目前在单子叶兰科植物中未见对miR172的研究，新发现的蝴蝶兰miR172基因无疑对进一步揭示兰科植物成花机理充实了基础，更重要的是，miR172在促进植物开花同时对营养生长的影响较小，最具投入生产、培育转基因早花株系的价值。
