基本信息
- 项目名称：
- 拟南芥热激因子AtAtHsfA1a表达纯化的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究以构建的表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的大肠杆菌E coli M15为材料，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达AtHsfA1a，再通过Ni-NTA-Agarose亲和层析纯化表达的AtHsfA1a，通过SDS-PAGE电泳分析表达蛋白和纯化蛋白，获得了表达纯化的AtHsfA1a。从基因表达调控水平上研究植物对逆境适应的分子机制和研究耐逆境基因的作用机理，提高植物各种抗逆性有重大意义。
- 详细介绍：
- 热激转录因子又称为热激因子（heat shock transcription factors，HSFs）是真核生物热激反应的主要转录调控因子。在拟南芥中存在21个热激因子的同源体，组成热激因子家族。虽然目前对绝大多数同源体的功能还不了解，但研究显示其中热激因子AtHsfA1a是与耐逆境有关的主要调控因子，对AtHsfA1a逆境信号转导机理研究显示，与大多数HSFs相似，在非逆境条件下，AtHsfA1a以非活性的单体形式存在，逆境诱导AtHsfA1a单体形成三体（活性）、与靶DNA启动子区热激元件（HSE）特异性结合，从而调控逆境防御基因的表达。然而，AtHsfA1a在逆境应答途径下游中如何诱导防御基因的表达仍然不清楚。 因此本研究以构建的表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的大肠杆菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)为材料，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达AtHsfA1a，再通过Ni-NTA-Agarose亲和层析纯化表达的AtHsfA1a，通过SDS-PAGE电泳分析表达蛋白和纯化蛋白，获得了表达纯化的AtHsfA1a。 本作品建立了稳定的适用于逆境应答研究的AtHsfA1a蛋白的表达、纯化体系，为研究AtHsfA1a的逆境应答行为提供研究材料，为进一步全面认识AtHsfA1a调控功能多样性的生理代谢基础奠定基础。从基因表达调控水平上研究植物对逆境适应的分子机制以及研究耐逆境基因的作用机理，对揭示植物耐逆境反应机理亦具有显著意义，也是进一步应用耐逆境基因改善植物耐逆性的理论基础，在农业上对提高植物各种抗逆性具有重大意义。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 转录因子如何接收和传导逆境信号和调控下游靶基因表达，目前没有足够依据揭示有关转录因子的逆境应答机理。本研究以构建的表达拟南芥热激因HsfA1a的大肠杆菌 M15为材料，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达AtHsfA1a，Ni-NTA-Agarose亲和层析纯化表达的AtHsfA1a，SDS-PAGE电泳分析表达蛋白和纯化蛋白，获得表达纯化的AtHsfA1a
科学性、先进性及独特之处
- 本作品建立稳定的适用于逆境应答研究的AtHsfA1a蛋白的表达、纯化体系，为研究AtHsfA1a的逆境应答行为提供研究材料。本项目将为进一步研究AtHsfA1a接受逆境信号的化学本质与机理，以及应用基因工程方法改AtHsfA1a耐逆境功能提供理论基础。本研究成果对揭示植物耐逆境机理具有重要意义,亦是用基因工程方法改善植物耐逆性的理论基础。
应用价值和现实意义
- 本研究结果为为研究AtHsfA1a的逆境应答行为提供研究材料，为进一步全面认识AtHsfA1a调控功能多样性的生理代谢基础奠定基础。从基因表达调控水平上研究植物对逆境适应的分子机制以及研究耐逆境基因的作用机理，对揭示植物耐逆境反应机理亦具有显著意义，也是进一步应用耐逆境基因改善植物耐逆性的理论基础，在农业上对提高植物各种抗逆性具有重大意义。
学术论文摘要
- 本研究以构建的表达拟南芥热激因子AtHsfA1a的大肠杆菌E coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)为材料，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达AtHsfA1a，再通过Ni-NTA-Agarose亲和层析纯化表达的AtHsfA1a，通过SDS-PAGE电泳分析表达蛋白和纯化蛋白，获得了表达纯化的AtHsfA1a。本研究结果为探讨拟南芥HsfA1a在基因组的结合位点提供实验材料，为进一步全面认识AtHsfA1a调控功能多样性的生理代谢基础奠定基础。
获奖情况
- 本作品是指导教师的科研课题，国家自然科学基金项目（31060039）、云南省自然科学基金面上项目（2010ZC163）。
鉴定结果
- 该作品具有实际应用价值。
参考文献
- 论文所采用技术： 1、大肠杆菌Escherichia coli M15(pET30a/ His6- AtHsfA1a)的诱导表达技术 2、镍柱亲和层析技术纯化蛋白技术。 3、SDS一PAGE电泳分析表达蛋白技术。 技术文献检索目录： 1、Schoffl F.et al 1998. Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol.117:1135-1141 2、Hubel and Schoffl 1994. Arabidopsis heat shock factor: Isolation and characterization of the gene and the recombinant protein. Plant Mol Biol 26: 353-362 3、Scharf KD, Rose S, ZottW, Schoffl F, Nover L. 1990. Three tomato genes code for heat stress transcription factors with a region of remarkable homology to the DNA - binding domain of the yeast HSF. EMBO J, 9 : 4495 -4501 4、Busch W et al 2005 Identification of novel Heat Shock Factor dependent genes and biochemical pathways in Arabidopsis thaliana Plant J 41: 1-14 5、Wu C. 1995. Heat shock transcription factors : structure and regulation . Annu Rev Cell Dev Biol, 11 :441 –469
同类课题研究水平概述
- 植物逆境信号转导的研究发现，转录因子在调控防御基因表达中起重要作用，然而目前还没有足够依据来清楚证实转录因子调控哪些防御基因，如何调控下游防御基因的表达。从基因表达调控水平上研究植物对逆境适应的分子机制以及研究耐逆境基因的作用机理，对揭示植物耐逆境反应机理亦具有显著意义，也是进一步应用耐逆境基因改善植物耐逆性的理论基础，在农业上对提高植物各种抗逆性具有重大意义。植物热激因子是真核生物热激反应的主要转录调控因子。目前对植物热激因子的研究主要是以模式植物为对象，例如拟南芥。在拟南芥中存在21个热激因子的同源体，组成热激因子家族。拟南芥热激因子家族基因最初由德国Tuebingen大学科研人员Schöffl, F. 等于90年代分离和克隆。虽然目前对绝大多数同源体的功能还不了解，但研究显示其中HsfA1a是与耐逆境有关的主要调控因子，对HsfA1a逆境信号转导机理研究显示，与大多数HSFs相似，在非逆境条件下，HsfA1a以非活性的单体形式存在，逆境诱导HsfA1a单体形成三体（活性）、以及与靶DNA结合，而且HsfA1a三体/靶DNA结合与热激蛋白基因的表达呈相关性，是诱导靶基因表达的重要步骤；通过比对拟南芥HsfA1a与其它HSFs序列，鉴定了HsfA1a分子具有DNA 结合域、多聚体域、激活域、细胞核定位信号和细胞核输出信号。然而，不清楚HsfA1a感应逆境的功能区域位点是什么，不清楚HsfA1a在逆境应答途径上游中如何感应逆境。目前国内外研究工作的兴趣主要是发现科学问题，还未见有关应用上的专利。申请人的目前研究显示，纯化的拟南芥全长HsfA1a(His-tag融合蛋白)在体外能感应高温、酸、碱、过氧化氢逆境，并由单体形成三体、与靶DNA结合。显示应用纯化蛋白可以模拟拟南芥HsfA1a的逆境应答行为。因此，本研究拟以构建的表达热激因子AtHsfA1a的大肠杆菌Escherichia coli M15 (pET30a/ His6- AtHsfA1a)为实验材料，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的诱导表达，获得表达的AtHsfA1a蛋白，并通过镍亲和层析获得纯化的AtHsfA1a蛋白，旨在为研究拟南芥AtHsfA1a在基因组的结合位点提供实验材料，为进一步全面认识AtHsfA1a调控功能多样性的生理代谢基础奠定基础。
