- 项目名称：
- 鄂西北产苍耳子甲醇粗提物抑菌活性及其清除DPPH能力的初步评价
- 简介：
- 随着化学农药在使用中产生的一系列公害问题被发现,如环境污染、杀伤天敌、破坏生态平衡等问题,已引起人们的普遍关注。利用植物体产生的次生代谢物质来开发“环境友好型农药”是现代农药开发的重要途径。本文采用生长速率法、孢子萌发法、DPPH自由基清除法，对产自鄂西北的野生植物苍耳子甲醇粗提物体外抑菌活性及抗氧化性进行了初步测定，为下一步植物性杀菌剂的开发提供理论基础。
- 详细介绍：
- 苍耳，学名Xanthium sibiricums属菊科一年生草本植物，别名苍子、苍耳子、野落苏，产于湖北、江苏、山东、江西等地，在传统中医临床中，苍耳子用于鼻渊头痛、外感风寒、风湿痹证等病症的治疗[1]。目前，对苍耳子活性物质参与有害病原微生物控制及其体外抗氧化性方面的研究鲜见报道。因此，本文采用菌丝生长法、孢子萌发法以及DPPH清除法，测定苍耳子甲醇粗体物对几种真菌的抑制活性及...(查看更多)DPPH清除活性，为下一步植物性杀菌剂的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试植物与微生物
苍耳子X. sibiricum seeds 采自湖北省襄阳市古隆中风景区，采集时间为5～6月份。采回后苍耳子置阴凉处晾干，粉碎后过40目筛后密封干燥保存。绿色木霉Trichoderma viride，黄瓜灰霉菌Botrytis cinerea，黑曲霉Aspergillus niger，终极腐霉Pythium ultimum，尖镰孢菌黄瓜转化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber，以上五个菌株由襄樊学院鄂西北植物资源研究所提供。
1.2 仪器与试剂
微型植物粉碎机(天津泰斯特)、旋转蒸发仪(上海亚荣)、紫外－可见分光光度计(日本岛津)、冰箱(青岛海尔)、显微镜(北京泰克)、高压灭菌锅(上海博迅)、光照培养箱(广东医疗)、电子分析天平(梅特勒-托利多)、空气恒温摇床(太仓华利达)、索氏抽提器；丙酮(上海国药，分析纯)、甲醇(上海国药，分析纯)、乙醇(上海国药，分析纯)、DPPH(美国SIGMA)、葡萄糖(上海国药，生化纯)、琼脂粉(上海国药，生化纯)。
1.3 苍耳子活性物质的粗提
苍耳子活性物质的提取采用连索氏抽提法，将粉碎的样品50g装入滤纸筒中，在索氏抽提器中用甲醇提取36 h，提取液用旋转蒸发仪浓缩，得浸膏，用丙酮定容为1g/mL，4℃密封保存备用。
1.4 苍耳子甲醇粗提物对病原物菌丝生长的抑制试验
菌丝生长的抑制活性用生长速率法测定。在无菌条件下，取提前配制的不同浓度粗提物溶液1ml与融化的PDA培养基9ml混合，摇匀，趁热倒入培养皿中制成平板(使供试药钟浓度分别达到0.004g/ml、0.002g/ml、0.0001g/ml)。同时，用丙酮设置对照组。待平板凝固后接入生长一致的菌饼(Φ=6.0 mm，菌丝面朝下)，每皿接1个菌饼，每处理重复3次。置平板于光照培养箱24℃培养至24h后，用十字交叉法测定供试真菌菌落生长直径，用下列公式计算菌丝生长的抑制率。
抑制率(%) =(对照菌落直径－处理菌落直径)÷对照菌落直径×100%
菌落直径(mm) = 测量菌落直径平均值－6.0
1.5 苍耳子甲醇粗提物对病原物孢子萌发的抑制试验
用无菌生理盐水冲洗长满孢子的培养基，将孢子冲进锥形瓶中，用纱布滤去杂质。在4个装有17ml液体PDA培养基的锥形瓶中加入1ml孢子悬浮液，再向其中3瓶加入2ml不同浓度苍耳提取液，使药液终浓度达到0.004g/ml、0.002g/ml、0.0001g/ml。另1瓶加2ml对照液(丙酮)，每个处理重复3次，置空气摇床中振荡培养。孢子萌发(以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发)后，用无菌水稀释到适当浓度(以10×10低倍镜下，每个视野30～40个孢子为宜)，加到血细胞计数板上，在10×10倍显微镜下观测。重复以上步骤，对四种供试菌种分别定时进行观测。孢子萌发抑制率的计算方法：
孢子抑制率(%)=(对照萌发数-处理萌发数)÷对照萌发数×100%
1.6 苍耳子甲醇粗提物清除DPPH自由基能力的测定
精密称取8.0 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)于50ml容量瓶中，用95%乙醇溶解；样品溶解于95%乙醇溶液中。取样品溶液1ml加入到离心管，再加入3ml的DPPH溶液配成样品溶液。95%乙醇溶液1ml加入到离心管，再加入DPPH溶液3ml配成未加样品液的DPPH溶液。取样品溶液1ml加入到离心管，再加入3ml的95%乙醇配成样品空白溶液。上述溶液在室温下离心20min后用紫外-可见分光光度计在517nm下检测。测定样品溶液吸光度Ai，未加样品液的DPPH溶液吸光度Ac,样品空白溶液吸光度Aj。根据下列公式计算清除率及半清除率(即IC50值)：
清除率=[1－(Ai－Aj)÷Ac]×100%
IC50=50％×消耗的DPPH质量／加入的试样溶液中溶质的质量
2 结果与分析
2.1 苍耳子粗提物对病原菌生长的抑制
苍耳子甲醇粗提物对五种病原真菌的菌丝生长都具有一定抑制作用（见表1），同一菌种粗提物浓度越高，抑菌作用越明显。随着稀释比例的增大，抑菌作用逐渐减小。在设置的最大质量浓度为0.004 g/ml时，最大抑制率分别是40.63%、39.73%、61.01%、44.55%、66.36%，其中，对尖镰孢菌黄瓜专化型的抑制活性最高，为66.36%；对黑曲霉的抑制作用最显著、效果最均一：即使在设定的最小质量浓度0.001 g/ml时，抑制率仍然达到43.67%，而此时对另外四种病原真菌的抑制率却很低，最高不到30%。
表1 苍耳子甲醇粗提物对病原真菌菌落的抑菌效果
Table 1 Inhibitory effect to pathogenic fungi colony of methanol extract of X. sibiricum seeds
供试菌种
Tested fungi CK 0.004 g/ml 0.002 g/ml 0.001 g/ml
直径Diameter
(mm) 直径Diameter
(mm) 抑制率Inhibitory rate(%) 直径Diameter
(mm) 抑制率Inhibitory rate(%) 直径Diameter
(mm) 抑制率Inhibitory rate(%)
绿色木霉
T. viride 36.6 21.73 40.63 28.14 23.11 30.11 17.73
黄瓜灰霉菌
B. cinerea 44.9 27.06 39.73 35.61 20.69 38.88 13.41
黑曲霉
A. niger 23.7 9.24 61.01 10.08 57.47 13.35 43.67
终极腐霉
P. ultimum 42.6 23.62 44.55 26.88 36.90 30.98 27.28
尖镰孢菌黄瓜专化型
F. oxysporum f. sp cucumber 20.6 6.93 66.36 12.08 41.36 16.70 18.93
注：菌落直径为5 次试验的平均值。
Note: All the numbers were averaged from experiments conducted five times.
2.2 苍耳子粗提物对病原真菌孢子萌发的抑制试验
由表2可知，苍耳子甲醇粗提物对绿色木霉、黄瓜灰霉菌、黑曲霉、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型五种真菌孢子萌发均有一定的抑制作用，在设置的最高质量浓度0.004 g/ml时，对上述真菌孢子的抑制率分别达到55.00%、89.19%、67.74%、94.12%，其抑制活性和抑制趋势与表1中的菌丝生长抑制作用相一致。
表2 苍耳子甲醇粗提物对病原真菌孢子萌发的抑制效果
Table 2 Inhibitory effect to spore germination of methanol extract of X. sibiricum seeds
供试菌种
Tested fungi CK 0.004 g/ml 0.002 g/ml 0.001 g/ml
萌发孢子(个) No. spore germinated 萌发孢子(个)No. spore germinated 抑制率
Inhibitory rate (%) 萌发孢子(个) No. spore germinated 抑制率
Inhibitory rate (%) 萌发孢子(个) No. spore germinated 抑制率
Inhibitory rate (%)
绿色木霉
T. viride 100 45 55.00 70 30.00 75 25.00
黄瓜灰霉菌
B. cinerea 112 54 51.79 80 28.57 87 22.32
黑曲霉
A. niger 185 20 89.19 35 81.08 50 72.97
终极腐霉
P. ultimum 155 50 67.74 60 61.29 85 45.16
尖镰孢菌黄瓜专化型
F. oxysporum f. sp cucumber 85 5 94.12 30 64.71 85 0
注：孢子萌发数目为3 次试验的平均值。
Note: All the numbers were averaged from experiments conducted three times.
2.3 苍耳粗提物对DPPH的清除能力
•DPPH是一种稳定的自由基，其结构含有三个苯环、一个带孤对电子的氮原子，醇溶液呈紫红色，在515 nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，•DPPH的孤对电子被配对而使溶液颜色变浅(黄色)，最大吸收波长处的吸收减弱。这种颜色变浅的程度与配对电予数是成化学剂量关系的，因此可用于评价自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力[2]。不同浓度粗提物清除•DPPH能力见表3。
表3 苍耳子甲醇粗提物清除DPPH自由基的IC50值
Table 3 The IC50 of methanol extracts of X. sibiricum seeds for eleminating DPPH free radical
浓度
concentration (g/ml) 清除率Eleminating rate (%) 回归方程
regression equation IC50(g/ml)
0.01 96.26 Y=49.3923X+0.4769 R=0.995 0.000468
0.005 73.14
0.0025 62.23
0.00125 54.41
0.000625 48.12
IC50值即清除50％自由基时，所需要的苍耳甲醇粗提物浓度。故IC50值越小，苍耳粗提物清除自由基的能力越强。由表3可知，苍耳子不同浓度粗提物对•DPPH均有清除能力，但其清除能力随着浓度的增加而增强，苍耳甲醇粗提物清除DPPH自由基的IC50为0.000468 g/ml。
3 小结与讨论
利用植物体产生的次生代谢物质来开发“环境友好型农药”是现代农药开发的重要途径。本文采用生长速率法、孢子萌发法、DPPH自由基清除法，对产自鄂西北的野生植物苍耳子甲醇粗提物体外抑菌活性及抗氧化性进行了初步测定。结果表明，苍耳甲醇粗提物对绿色木霉、黄瓜灰霉菌、黑曲霉、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型五种病原真菌均有一定的抑制作用，其中无论是抑制菌丝生长还是孢子萌发，均对黑曲霉显示出了显著的抑制作用；同时，苍耳甲醇粗提物对DPPH自由基具有较强的清除能力，IC50为0.000468 g/ml。
鄂西北产苍耳子甲醇粗提物是一种混合物，到底由哪些成分组成？究竟是哪一种或几种物质在起抑菌作用？这些都有待继续深入研究。同时，混合物中某些成分可能会对某些病菌具有促进生长作用。若对粗提物进一步分离纯化，可能会得到只对病菌具有抑制作用的化学物质，且抑菌作用会在很大程度上提高。
参考文献
[1]TAN Dao-peng(谭道鹏),WU Zhi-gui(吴志瑰),ZHU Xiao-lan(褚小兰),et al. Study progress of chemical components of plants from Xanthium L.(苍耳属植物化学成分研究进展)[J]. Lishizheng medicine and materia medica reserch( 时珍国医国药).2007,18(2):501-502
[2]Sopheak Son, Betty A. Lewis. Free radical scavenging and antioxidant activity of caffeic acid amide and ester analogues：structure-activity relationship[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, (50):468-472
(收起)
