基本信息
- 项目名称：
- 宁强矮马与哈萨克马GHR外显子10部分序列变异分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 通过对宁强矮马、哈萨克马和其他动物生长激素受体基因外显子10部分序列进行分析，为宁强矮马、哈萨克马的分子系统学地位和生长机制的研究提供分子水平的科学依据。通过PCR扩增宁强矮马和哈萨克马的生长激素受体基因外显子10部分序列，并进行测序，用DNAMAN软件对不同动物的生长激素受体基因外显子10部分序列进行比对分析。
- 详细介绍：
- 宁强矮马与哈萨克马GHR外显子10部分序列变异分析 王进，张晓康 张翠翠 刘芳妮 （陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000） [摘要] 【目的】通过对宁强矮马、哈萨克马和其他动物生长激素受体基因外显子10序列进行分析，为宁强矮马、哈萨克马的分子系统学地位和生长机制的研究提供分子水平的科学依据。【方法】通过PCR扩增宁强矮马和哈萨克马的生长激素受体基因外显子10，并进行测序，用DNAMAN软件对不同动物的生长激素受体基因外显子10序列进行比对分析。【结果】所研究的个体间有1个SNP位点，以家马生长激素受体基因外显子108序列（AF39287）为标准，宁强矮马539位点缺失1个碱基A，哈萨克马该位点由A→G，这些变异导致氨基酸发生改变，可能影响其生物学功能。本研究以生长激素受体基因外显子10序列为基本数据对不同物种进行系统树构建，发现在该位点上，所选动物的亲缘关系与生物进化树一致。 [关键词] 宁强矮马;哈萨克马;GHR外显子10;序列分析 Variation Analysis of Part Sequences of GHR Exon 10 in Ningqiang Pony and Kazakh Horse (School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi) Abstract: 【Objective】In order to provide scientific basis for the origin and growth mechanism of Ningqiang pony and Kazakh horse, the sequence of GHR exon10 of Ningqiang pony, Kazakh horse and other animals was studied. 【Method】In the study, the PCR amplification, sequencing and DNAMAN software were used to analyze the sequences of GHR exon10 of different animals. 【Result】There was one SNP locus in the coding region. As the sequence of AF392878 as standard, we found there was a base deletion of A in Ningqiang pony and a transition of A→G in Kazakh horse, all these variations can cause amino acid change. Through analysis of clustering based on the sequence of GHR exon10, the genetic relationship of animals in the study was identical with biological cladogram. Key words: Ningqiang horse:，Kazakh horse;，GHR exon 10， SSCP，Sequences analysis 马（Equus caballus ）属于哺乳纲(Mammalia)奇蹄目(Perissodaetyla)马科（Equidae）、马属（Equus）,公认其起始于北美洲，古生物学家在中国发掘的资料却证明，我国也是世界上马种起源最早的国家之一。我国马种极为丰富，按照马种的历史来源、生态环境及体尺类型等综合因素分为五大类型。（一）蒙古马、（二）西南马、（三）河曲马、（四）哈萨克马、（五）西藏马 [1]。宁强马属西南马种，是陕西地方品种，以体质紧凑结实，耐艰苦，体形轻小，适应山区自然条件等为特征。宁强马品种中存在一种低于106cm的矮马群体，被称为宁强矮马，它是濒临绝迹的我国珍稀矮马品种[2]。哈萨克马产于新疆，是一种草原型马种，头中等大，清秀，耳朵短。颈细长，稍扬起，耆甲高，胸销窄，后肢常呈现刀状。现今伊犁哈萨克州一带，即是汉代西域的乌孙国。两千年前的西汉时代，汉武帝为寻找良马，曾派张骞三使西域，得到的马可能就是哈萨克马的前身。到唐代中叶，回纥向唐朝卖马，每年达十万匹之多[3]。其中很多属于哈萨克马。因此，中国西北的一些马种大多与哈萨克马有一些血缘关系。 生长激素受体(GHR)是一种跨膜糖蛋白，是细胞因子／造血因子受体超家族的成员之一，大约有638个氨基酸残基．分为3个区：胞外区、跨膜区和胞内区。由于生长激素为生物大分子，不能直接透过细胞膜，因此生长激素(GH)要发挥生长和代谢作用必须和其受体(GHR)相结合，它通过二聚体的形式和生长激素相结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能[4]。马的GHR基因在第21号染色体，包含10个外显子，GHR基因转录的mRNA由1917 bp组成，GHR基因第10外显子由904 bp组成，编码301个氨基酸，形成胞内结构域[5,6]。本研究通过通过PCR技术扩增宁强矮马和哈萨克马的GHR基因第10外显子并进行测序，通过与从GenBank获得的马和其他动物GHR基因外显子10序列进行比对分析，分析宁强矮马、哈萨克马GHR基因的遗传变异及其马属动物在该位点上的分子系统学地位，从生长激素受体基因探讨宁强矮马的矮化机制。 1 材料和方法 1.1 实验材料及DNA提取 本研究采用简单随机抽样法采集10匹宁强矮马、12匹哈萨克马血样，加ACD抗凝，放入-70℃超低温冰箱保存，根据分子克隆实验指南[7]，采用酚－氯仿抽提法提取基因组DNA， 4℃保存。 1.2引用序列和引物序列 由网站 查得不同动物生长激素受体基因序列（见表1），并根据马外显子10的序列（AF392878）采用软件Primer5.0设计用于PCR扩增GHR exon10 部分序列的引物（见表2），引物序列由上海捷瑞生物科技有限公司合成。 表1 从GenBank引用的各种动物的GHR序列 种属 GenBank登录号 品种 马属(Equus caballus) AF392878 家马horse 犬属(Canis lupus familiaris) AY885397 狗(dog) 猪属（Sus scrofa） NM_214254 家猪(Pig) 绵羊(Ovis aries) NM_001009323 绵羊(sheep) 牛属(Bos taurus) NC_007318 家牛(cattle) 鼠属(Rattus norvegicus) NC_005101 沟鼠（Norway rat） 欧洲兔（Oryctolagus cuniculus） NC_013679 索贝克（Thorbecke） 黑猩猩(Pan troglodytes) NC_006472 黑猩猩chimpanzee 人类(Homo sapiens) NC_000005 人human 鸡(Gallus gallus) NC_006127 红色原鸡（red jungle fowl） 爪蟾(Xenopus laevis) NM_001088509 非洲爪蟾(African clawed frog) 鱼(Oryzias latipes) NM_001122905 日本青鳉（Japanese medaka） 表2 引物序列及最适退火温度 引物名称 引物序列(5`→3`) 起止位点 扩增片段长度 退火温度 GHR-1 F:GTTGCTCAGCCACAAAGGTT 254 470 216 57.4 R:TTGCCAGTGAACTCGGATTG GHR-2 F:GAGTTCACTGGCAAACATCG 457 739 282 57.4 R:AAGGCTTTCTGTGGTGATGT 1.3 PCR扩增反应体系及程序 PCR反应总体系为25μL：10×PCR缓冲液(含15mM Mg2+)2.5μL，dNTP (25mM) 2.0μL，上下游引物 (10pmol)各1 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL ，DNA模板 (50ng/μL) 2.0μL，超纯水16.3μL。 PCR扩增条件：94℃预变性2min， 94℃变性30s，Ｘ℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，然后72℃延伸10 min，4℃保存。 1.4统计分析 采用DNAMAN分析软件对宁强矮马和哈萨克马生长激素受体基因exon10的部分序列进行比对分析，并以GHR外显子10序列为基础对马及其他几种动物进行了进行了同源性分析和系统树构建。 2 结果与分析 2.1两种中国地方马GHR列比对分析 马的GHR基因是在第21号染色体，GHR基因包含10个外显子，GHR基因转录的mRNA由1917 bp组成，其中第10外显子由904bp组成，编码301个氨基酸。通过对宁强马、哈萨克马两种马种3个个体生长激素受体基因GHR外显子10序列研究发现：哈萨克马19号与GenBank公布的马的GHR exon10（AF392878）一致，宁强矮马1号和哈萨克马1 8号均在539位点发生变异（如图5）。宁强矮马1号发生缺失突变，引起该位点以后AA序列的变异，从而导致宁强矮马生长激素受体的变化，影响其功能的，这可能造成宁强马矮化机制形成的一个因素。哈萨克马1 8号此处由A→G，导致此处氨基酸由Lys→Arg，可能影响生长激素受体结构和功能的改变。 马-AF392878 CTCAACTAAGCAATCCGAGTTCACTGGCAAACATCGACTTTTATGCCCAGGTAAG 495 哈萨克马19-3 ------------------------------------------------------- 495 哈萨克马18-3 ------------------------------------------------------- 495 宁强矮马1-3 ------------------------------------------------------- 495 马-AF392878 CGACATTACGCCAGCAGGGAGTGTGGTCCTTTCCCCGGGCCAAAAAAACAAGACA 550 哈萨克马19-3 ------------------------------------------------------- 550 哈萨克马18-3 -------------------------------------------g----------- 550 宁强矮马1-3 -------------------------------------------.----------- 549 马-AF392878 GGGATATCCCAATGTGACATGCATCCCGAAGTGGTCTCACTCTGCCAAGCCAACT 605 哈萨克马19-3 ------------------------------------------------------- 605 哈萨克马18-3 ------------------------------------------------------- 605 宁强矮马1-3 ------------------------------------------------------- 604 图5 马生长激素受体基因外显子10区部分序列比对分析 2.2不同物种GHR外显子10的同源性和系统进化树分析 本研究通过比对分析了从鱼到人12种脊椎动物的生长激素受体基因GHR exon10的DNA 序列（见图6），发现猪和马的GHR序列同源性最高，达到91.9%，其次为狗和马，达到90.8%。各种动物GHR exon10 序列的同源性与生物的进化关系基本一致，人同黑猩猩同源性最高，为99.2%，其次为牛和羊97.2%，哺乳动物GHR exon10的同源性较高，其次与鸡，然后是非洲爪蟾，同源性最低的是与鱼。 以生长激素受体基因GHR exon10为基本数据进行12种脊椎动物的系统进化树构建（见图7），结果发现狗和马聚为一类，绵羊与牛聚为一类，人与黑猩猩聚为一类，然后绵羊、牛、马、狗和猪聚为一大类，说明在马属动物马属动物与猪和狗的亲缘关系最近，绵羊和牛与马的关系较近，灵长目与马属亲缘关系与马稍远，其次为兔、鼠、鸡和非洲爪蟾，鱼与马属的亲缘关系最远。 表3 各种动物生长激素受体外基因外显子10序列的同源性和遗传距离 物种 猪 爪蟾 狗 黑猩猩 鸡 马 绵羊 牛 人 鼠 兔 鱼 猪 - 61.6 89.6% 89.3% 68.9% 91.9% 91.4% 91.1% 88.7% 79.3% 86.1% 38.8% 爪蟾 0.384 - 60.6% 60.2% 61.4% 62.1% 61.7% 61.0% 60.1% 59.6% 61.3% 38.1% 狗 0.104 0.394 - 86.0% 68.4% 90.8% 86.7% 86.5% 85.8% 79.5% 83.7% 40.5% 黑猩猩 0.107 0.398 0.140 - 67.8% 89.4% 87.4% 87.3% 99.2% 79.0% 84.7% 38.2% 鸡 0.311 0.386 0.316 0.322 - 69.3% 67.7% 67.5% 67.6% 64.1% 66.8% 38.8% 马 0.081 0.379 0.092 0.106 0.307 - 89.7% 89.9% 89.3% 78.8% 86.8% 38.9% 绵羊 0.086 0.383 0.133 0.126 0.323 0.103 - 97.2% 87.1% 78.7% 84.1% 38.8% 牛 0.089 0.390 0.135 0.127 0.325 0.101 0.028 - 86.9% 77.7% 83.6% 39.0% 人 0.113 0.399 0.142 0.008 0.324 0.107 0.129 0.131 - 78.8% 84.0% 37.9% 鼠 0.207 0.404 0.205 0.210 0.359 0.212 0.213 0.223 0.212 - 75.9% 39.4% 兔 0.139 0.387 0.163 0.153 0.332 0.132 0.159 0.164 0.160 0.241 - 38.9% 鱼 0.612 0.619 0.595 0.618 0.612 0.611 0.612 0.610 0.621 0.606 0.611 - 图6 不同物种生长激素受体基因外显子10序列的同源树 图7 基于生长激素受体基因外显子10序列的构建的不同物种的系统进化树 3 讨论 随着人们对生物多样性重要性认识的不断深入，马属动物的研究也渐渐受到了重视，尤其是矮马的保护和研究受到了政府的重视和扶持。纵观人类社会的发展，矮马业几经沉浮，曾经分布广泛兴盛一时，但因为不适应军事和生产上对畜力的需求而被淘汰或被杂种马所取代[8]。中国矮马是世界除英国设特兰矮马（Shetland Pony）外，另一个最大的原始矮马资源库，主要分布在西南地区，分别为 广西矮马（Guangxi Pony）、 贵州矮马（Guizhou Pony）、云南矮马（YunnanPony）、四川矮马（Sichuan Pony）和陕西矮马（ShaanxiPony），且这些马受外来品种入侵较小，保持了较为完整的基因库，遗传资源丰富[9]。人民生活水平提高促进了娱乐生活更加多样化，在旅游、观赏和儿童活动等方面，矮马具有很高的潜在价值，矮马品种的保护开发和专门化培育受到了学者、企业和相关部门的高度重视，那么研究影响生长性状的基因对我国矮马品种进一步矮化培育有重要意义 目前，多数学者的研究主要集中在中国马的遗传多样性及其起源进化方面，例如芒来研究了蒙古马等北方马种的遗传多样性[10,11]，安丽萍等也只是通过细胞色素b探讨了普氏野马与蒙古马的遗传多态性[12]，雷初朝研究了中国马的起源进化等[13]。随着马分子水平研究的深入和其开发利用途径的拓展，马的功能基因的研究也在不断扩充，芒来等研究了蒙古马的生长激素基因、多巴胺D4受体基因、5一羟色胺能基因、Mu阿片受体基因、IGF-I基因、ELA—DQA基因和MSTN基因等[14-22]，蒋钦杨等研究了广西百色矮马的GH和GHR基因[23]，张涛等研究了宁强矮马的GH基因[24]，这都为中国马种的保护和开发奠定了一定得分子生物学基础，也将促进中国马业的快速发展。 本研究以NCBI公布的家马生长激素受体基因外显子10序列为标准，进行分析发现哈萨克马19与公布序列一致，哈萨克马1 8号在539为由A→G，宁强矮马1号在539位发生缺失突变，导致AA序列的变异。以GHR序列为基础的聚类分析表明马属动物GHR exon10的同源性最高，其序列与猪的最为接近达到91.9%，与鱼类最远，本研究结果符合生物系统进化树关系,为马属动物的进化在GHR基因方面提供了补充材料，也为宁强矮马矮小机制和哈萨克马的生长发育研究奠定分子遗传学了基础。
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撰写目的和基本思路
- 目的：通过对陕西汉中宁强马生长激素受体基因外显子10的序列进行分析，宁强马的起源和矮小机制的研究提供分子水平的科学依据。 基本思路：样本采集-DNA提取——GHRexon10 PCR扩增引物设计——PCR扩增——SSCP分析——基因型判定——PCR产物测序——序列比对分析——基因功能预测——基于该位点进行聚类分析。
科学性、先进性及独特之处
- 该文章采用PCR-SSCP和测序技术在生长性状相关的基因GHR上对宁强马的矮小形成机制进行了初步探讨，并在该位点进行不同物种的系统进化关系研究，发现了宁强马在GHR exon 10 上存在一个碱基缺失，可能与其生长发育有关，通过聚类分析发现马与猪的GHRexon10序列同源性最高。
应用价值和现实意义
- 该研究结果为宁强马矮化机制形成提供给了分子生物学依据，并为其起源进化方面研究补充了GHR方面的资料。该成果为宁强马的资源保护和开发奠定了基础，具有很好的潜在科学价值。
学术论文摘要
- 本研究主要目的是通过对宁强矮马、哈萨克马和其他动物生长激素受体基因外显子10序列进行分析，为宁强矮马、哈萨克马的分子系统学地位和生长机制的研究提供分子水平的科学依据。该实验通过PCR扩增宁强矮马和哈萨克马的生长激素受体基因外显子10，并进行测序，用DNAMAN软件对不同动物的生长激素受体基因外显子10序列进行比对分析。研究发现两个品种不同个体间有1个SNP位点，以家马生长激素受体基因外显子108序列（AF39287）为标准，宁强矮马539位点缺失1个碱基A，哈萨克马该位点由A→G，这些变异导致氨基酸发生改变，可能影响其生物学功能。本研究以生长激素受体基因外显子10序列为基本数据对不同物种进行系统树构建，发现在该位点上，所选动物的亲缘关系与生物进化树一致。
获奖情况
- 该论文投在《贵州农业科学》，已经被录用，将在2011年7月中旬见刊。
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]陕西省家畜家禽品种志编辑委员会.陕西省家畜家禽品种志[M].三泰出版社,1988. [2]姚全福,赵一萍,芒来,等.我国地方马种质资源多样性研究进展[J].畜牧与食料科学，2009,30（10）：126-129. [3]SUN Xiaofeng , GUO Qionglin,HU Wei1，etal. Molecular cloning of growth hormone receptor (GHR) fromcommon carp(Cyprinus carpioL.) and identification of itstwo forms of mRNA transcripts[J]. PROGRESS IN NATURAL SCIENCE,2006,16(11):1156-1163. [4]翻李虹．生长激素和生长激素受体的多样性[J].生物学杂志，2002,19(4)：10-12. [5]楚冬梅．生长激素受体基因单核苷酸多态性与特发性矮小的相关性[J]，医学综述，2007，l 1(13)：833-835． [6]萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T著.金冬雁,黎孟枫,侯云德等译.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京：科学出版社,1992,463-481. [7] Lei CZ, Su R, Bower MA, Edwards CJ, Wang XB, Weining S, Liu L, Xie WM, Li F, Liu RY, Zhang YS, Zhang CM, Chen H. Multiple maternal origins of native modern and ancient horse populations in China[J]. AnimalGenetics, 2009, 40(6): 933-944. [8] 张焱如, 乌尼尔夫, 芒 来. 三河马生长激素基因的克隆与序列分析[J]. 华北农学报, 2006, 21 (4): 110-113.
同类课题研究水平概述
- 目前，多数学者的研究主要集中在中国马的遗传多样性及其起源进化方面，例如芒来研究了蒙古马等北方马种的遗传多样性，安丽萍等也只是通过细胞色素b探讨了普氏野马与蒙古马的遗传多态性，雷初朝研究了中国马的起源进化等。随着马分子水平研究的深入和其开发利用途径的拓展，马的功能基因的研究也在不断扩充，芒来等研究了蒙古马的生长激素基因、多巴胺D4受体基因、5一羟色胺能基因、Mu阿片受体基因、IGF-I基因、ELA—DQA基因和MSTN基因等，蒋钦杨等研究了广西百色矮马的GH和GHR基因，张涛等研究了宁强矮马的GH基因，这都为中国马种的保护和开发奠定了一定得分子生物学基础，也将促进中国马业的快速发展。
