基本信息
- 项目名称：
- 大理地区健康人阴道念珠菌药物敏感性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 通过对分离的大理地区念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。采用微量液基稀释法，测定念珠菌对氟康唑（Fluconazole, FCZ）、酮康唑（Ketoconazole, KCZ）、5-氟胞嘧啶（5-flucytosine,5-FC）和两性霉素B（Amphotericin, AMB）共4种常用抗真菌药物的敏感性（MIC值） 。
- 详细介绍：
- 大理地区健康人阴道念珠菌药物敏感性研究 姚毅1、白丽2、陈财发1、何伟1、朱文1 [摘要] 目的 通过对分离的大理地区念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。方法 采用微量液基稀释法，测定念珠菌对氟康唑（Fluconazole, FCZ）、酮康唑（Ketoconazole, KCZ）、5-氟胞嘧啶（5-flucytosine,5-FC）和两性霉素B（Amphotericin, AMB）共4种常用抗真菌药物的敏感性（MIC值）。结果 45株健康人群阴道念珠菌对抗真菌药物FCZ 、AMB、5-FC 、KCZ的耐药率分别为：8.9%、0%、6.7%、6.7%，敏感率分别为80%、64%、93%、84%。 结论 45株念珠菌对四种抗真菌药物的耐药率无显著性差异，敏感率除5-FC的敏感性比AMB好（P=0.001），KCZ的敏感性比AMB好（P=0.031）外，其余药物的敏感率无显著性差异（P＞0.05）。上述四种临床常用抗真菌药物可选作阴道念珠菌病的治疗，但应注意某些菌株的剂量依赖性敏感和耐药现象。 关键词:药物敏感性; 体外;念珠菌;健康人群 Research the antifungal susceptibility to vaginal candida in healthy subjects in Dali Yao Yi, Bai Li, Chen Cai Fa, He Wei , Zhu Wen ABSTRACT: Through antifungal susceptibility test of isolates of candida in Dali area, for clinical basis for selection of antifungal drugs. Detect the antifungal susceptibility (MIC) of candida to fluconazole (Fluconazole, FCZ), ketoconazole (Ketoconazole, KCZ), 5-fluorocytosine (5-flucytosine, 5-FC) and amphotericin b (Amphotericin, AMB) a total of 4 kinds of antifungal drug by using micro-liquid-based dilution method. Result: 45 strains vaginal candida in healthy subjects antifungal drug FCZ, AMB, KCZ, 5-FC resistance rate respectively are: 8.9%, 0%，6.7%, 6.7%,sensitive rate respectively for 80%, 64%, 93%, 84%. Conclusions：45 strains candida of four antifungal drugs resistant no significance difference, sensitive rate except 5 - FC sensitivity than AMB good (P = 0.001), the sensitivity of the KCZ than AMB good (P = 0.031) outside, the rest of drug sensitive rate has no significant difference (P > 0.05). The above four kinds of commonly used clinical antifungal drugs optional for treatment of vaginal candida， but should be aware that some strains of dose-dependent phenomenon of sensitive and resistant. KEY WORDS: antifungal susceptibility; candida ; healthy subjects [基金项目] 大理学院2010年大学生科研基金资助 [作者单位] 1.大理学院临床医学专业07级1班，大理 671000 2. 大理学院医学微生物及免疫学教研室，大理 671000 [通讯作者] 白 丽，E-mail：bailiqian@ 念珠菌属条件致病性酵母样真菌，常寄生于人体与外界相通的腔道中，如口腔、 肠道、 阴道等，健康人群携带率较低（口腔中约 9% ）。由各种原因（如HIV 感染等）导致机体抵抗力下降、 菌群失调或寄生位置发生改变而的真菌发病率越来越高，其中主要是念珠菌病。随着唑类药物在粘膜念珠菌病中的广泛使用，念珠菌的敏感性逐渐降低，耐药株呈现增加趋势。采用美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory standards,NCCLS )推荐的微量稀释法测定念珠菌的药物敏感性。通过对分离的大理地区念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。 1材料与方法 1.1主要试剂 沙氏琼脂培养基（Sabouraud dextrose argar）、RPMI—1640干粉、三氮吗啡丙磺酸（3-N-morpholinopropanesulfonicacid,MOPS）、抗真菌药物储备液：两性霉素B（AmphotericinB,Amb）5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine,5-FC），氟康唑（Ketoconazole,KETO）（中国药品生物制品检定所）1mol/L NaOH溶液。 1.2主要仪器 电子天平(AB204-5,METLER TOLEDO)、-20℃冰箱（Forma Scientific,USA）和-70℃冰箱（REVCO ULT1386-3-U37,USA）、微量移液器、细胞计数器、普通光学显微镜、96孔微量培养板、隔水式恒温保养箱（water-jacket constant temperature incubator, GSP-9160MBE, Boxum）、干烤箱（101A-2，上海崇明实验仪器）、高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SⅡ）、超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化)、0.22um滤过膜、滤器、磁力搅拌器。 1.3实验菌株 选择大理地区健康人阴道念珠菌的分离株(45株),已保存于白丽教授实验室。 1.4标准菌株 ATCC10029作为四种药物的敏感性标准珠。 1.5 RPMI—1640液的配置 取10.4g RPMI-1640粉(含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBCO)溶于900ml无菌水中，加入34.53g 三氮吗啡啉丙磺酸(MOPS，夏斯生物)至其终浓度为0.165mol/L，室温下用磁力搅拌器混匀2h～3h，使其充分溶解，用1mol/L NaOH调pH至7.0（25℃），用灭菌双蒸水定容至1L，滤过除菌，备用。 1.6抗真菌药物 1.6.1储存液 储存液为应用液10倍，5-FC和FCZ为1280µg/mL,Ambhe KETO为320µg/mL，分装于-70℃保存备用。 1.6.2应用液的制备 用RPMI-1640液将储存液作1:10稀释后再做倍比稀释，FCZ和5FC为128µg/ML～0.25µg/mL10个系列浓度，Amb和KETO为32µg/mL～0.06µg/mL10个系列浓度，均为两倍终浓度。 1.6.3微量药敏培养板的制备 使用96孔平底微量培养板，1～10列分别加入10浓度梯度的抗真菌药物的应用液，从高浓度到低浓度，11列加入RPMI-1640液（作为生长对照），每孔100µL，12列作为空白对照，放入-20℃冰箱备用，使用时需经-4℃、4℃和室温各1h。 （注：重复使用96孔平底微量培养板，需严格处理。用0.05～0.1％的新洁尔液浸泡过夜，清水洗涤后凉干，再用75％的酒精浸泡后用灭菌双蒸水冲洗，在紫外线下照射凉干，无菌保存备用。） 1.7药敏试验 1.7.1念珠菌的激活与稀释 将待测菌株在YPD（1％yeast extract,1%peptone，2%dextrose）琼脂培养基上两次激活后，取直径大于1mm的菌落少许于3ml无菌生理盐水中摇匀后制成菌悬液，取少许，用血细胞计数板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为X×104cfu/mL，用RPMI-1640液调整浓度为3×103cfu/mL(2倍终浓度)。 1.7.2加样 在上述制备好的含抗真菌药物的培养板上加入念珠菌悬液，每孔100µL，空白对照不加，振荡混匀后放入湿盒中（防止微量板中的液体挥发而影响药物浓度），35℃孵育24～48h后观察结果。 1.7.3结果判断 肉眼判断结果，以生长对照孔为依据，Amb为完全抑制即MIC100作为观察终点，液体清亮；其余三种药以80%抑制作为观察终点，菌体生长明显减少，液体轻微浑浊，即MIC80为观察终点，同时阳性生长对照中生长良好，空白对照清亮，无菌生长，质控菌株MIC值在CLSI M27-A2方案规定的范围内，才能判断实验的有效性。 2实验结果 2.1质控菌株对抗真菌药物的敏感性 质控菌株对抗真菌药物的MIC值符合CLSI M27-A2 方案关于质控菌株标准的要求[1]。 2.2四种常用抗真菌药物对45株念珠菌的敏感性（ MIC值）分布见表1至表4. 表1 FCZ对45株念珠菌MIC值（µg/mL） 组别 ≥64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 ≤0.125 累计 4 1 4 9 10 4 3 6 3 0 表2 5-FC对45株念珠菌MIC值（µg/mL） 组别 ≥64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 ≤0.125 累计 3 0 0 1 1 3 2 0 1 34 表3 KCZ对45株念珠菌MIC值（µg/mL） 组别 ≥16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.06 ≤0.03 累计 0 0 1 1 1 2 2 5 8 25 表4 Amb对45株念珠菌MIC值（µg/mL） 组别 ≥16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.06 ≤0.03 累计 0 0 9 7 7 14 6 1 1 0 2.3四种常用抗真菌药物对45株念珠菌敏感性（MIC值）的异同。 5-FC和KCZ对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布都呈偏态分布（图1和图2）。5-FC对念珠菌的MIC值主要分布于“≤0.125”范围内（图1），75.6%的念珠菌MIC值分布于此范围内。KCZ对念珠菌的MIC值主要分布于“≤0.03”范围内（图2），55.6%的念珠菌MIC值分布于此范围内。其余各浓度阶段都有一定量的念珠菌分布，虽然分布的量上有一定的差异，但主次较明显。就体外药物敏感试验而言，两组药的敏感菌株较多，剂量依赖性菌株和耐药性菌株较少。 图1 5-FC对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布 图2 KCZ对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布 FCZ和Amb对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布都呈正态或近似正态分布（图3和图4）。FCZ对念珠菌的MIC值主要分布于“4g/ml”范围内（图3），22.2%的念珠菌MIC值分布于此范围内。Amb对念珠菌的MIC值主要分布于“0.5 mg/ml”范围内（图2），31.1%的念珠菌MIC值分布于此范围内。就体外药物敏感试验而言，FCZ的敏感性菌株较多，剂量依赖性和耐药性菌株都较少。AMB敏感菌株最多，剂量依赖性敏感菌株次之，无耐药菌株。 图3 FCZ对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布 图4 Amb对45株念珠菌的敏感性（MIC值）分布 2.4四种常用抗真菌药物的敏感性 关于念珠菌对抗真菌药物的敏感性的判断，CLSI推荐的M27方案仅对氟康唑和伊曲康唑作了规定，而其他的抗真菌药物未做规定，本文参照Priscilla de Laet Sant’Ana [2]等人的规定和E-Test方法[3]，判断念珠菌的敏感程度，分为敏感（susceptibile ，S）、 剂量依赖性敏感（susceptibile dose-dependent ，SDD）、和耐药（resistant ，R）三种（表5），根据此判断标准将45株念珠菌对4种药物的敏感性如下（表６） 。 表5 抗真菌药物敏感性判断标准(MIC) MIC(µg/ mL) S SDD R 氟康唑( FCZ) ≤8 16～32 ≥64 酮康唑( KETO) ≤0.125 0.25～0.5 ≥1 氟胞嘧啶( 5-FC) ≤8 16 ≥32 两性霉素 B( Amb) ≤1 2～4 ≥8 S: susceptible（敏感）、SDD: susceptible dose-dependent（剂量依赖性敏感）、R: resistant（耐药） 表6 45株念珠菌对4种药物的敏感性 S SDD R FCZ 36 5 4 AMB 29 16 0 5-FC 42 0 3 KCZ 38 4 3 2.5四种抗真菌药物的耐药率比较 R S/SDD 合计 耐药率（%） FCZ 4 41 45 8.9 AMB 0 45 45 0 5-FC 3 42 45 6.7 KCZ 2 43 45 6.7 合计 9 171 180 5 经卡方经验x2=3.791,P=0.285,四种药物的耐药率无显著差异。 2.6四种抗真菌药物的敏感率比较 S SDD/R 合计 敏感率（%） FCZ 36 9 45 80 AMB 29 16 45 64 5-FC 42 3 45 93 KCZ 38 7 45 84 合计 145 35 180 81 经卡方经验x2=12.521,P=0.006,四种药物的敏感率有显著差异，经铁和两两经验。 (1) FCZ与AMB，Z=−1.638，p =0.101，FCZ与ZMB药物敏感性无显著差异。 (2)FCZ与5-FC，Z=−1.850，P=0.064，FCZ与5-FC药物敏感性无显著差异。 (3)FCZ与KCZ，Z=−0.548，P=0.583，FCZ与KCZ药物敏感性无显著差异。 (4)AMB与5-FC，Z=−3.359，P=0.001，FCZ与KCZ药物敏感性有显著差异，5-FC的敏感性比AMB好。 (5) AMB与KCZ，Z=−2.163，P=0.031，FCZ与KCZ药物敏感性有显著差异，KCZ的敏感性比AMB好。 (6)5-FC与KCZ，Z=−1.134，P=0.182，5-FC与KCZ药物敏感性无显著差异。 即：45株对四种抗真菌药物的耐药率无显著性差异，敏感率除5-FC的敏感性比AMB好（P=0.001），KCZ的敏感性比AMB好（P=0.031）外，其余药物的敏感率无显著性差异（P＞0.05） 。 3讨论 体外抗真菌药物敏感性试验影响因数较多，如试验方法、培养基、培养温度、PH、接种菌量、培养时间等，其中一项或几项发生改变都会影响试验的结果，CLSI推荐的M27-A2[1]方案中规定，微量液基稀释法测酵母样真菌（单细胞真菌）的药物敏感试验，必须设立对照和质控株，对照包括空白对照和阳性生长对照。设立质控菌株是为了增加试验菌株的可比性，质控菌株必须有明确的来源，可靠的保存方式并按规定使用。所测定的质控株MIC值在该方案中推荐的范围内方认为待测菌株的MIC值是有效的。 目前，有关念珠菌体外抗真菌药物敏感性和体内药物敏感性的关系还不清楚，CLSI规定的判断标准仅是属于体外抗真菌药物敏感性的界定，并非体外耐药就意味着体内也耐药，同样，体外敏感的在体内也不一定敏感，毕竟人体是一个复杂的环境，药物在体内受多方面的影响，而且机体各指标变化快，难于控制到像体外一样恒定，使得抗真菌药物在体内的用药机制更加复杂，但是，统一标准化的体外药物敏感实验仍可以作为临床体内用药的大体判断。 在过去的20多年中，随着AIDS出现、肿瘤患者对化疗的广泛使用及器官移植的普遍开展，真菌的机会性感染呈日益增多趋势，而抗真菌药物在临床的推广使用，又导致了真菌耐药问题的出现。目前，在抗真菌药物非常有限的条件下，耐药真菌的出现无疑给临床治疗带来了巨大的挑战，这一点已引起国内外学者的瞩目。1958年，灰黄霉素的出现标志着真菌病系统治疗的开始，但因其毒性大、抗菌谱窄而未能在临床广泛使用。随后20世纪70～90年代，唑类抗真菌药物如：酮康唑（KCZ）、氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）相继问世，成为治疗系统性念珠菌的有效药物，对HIV阳性人群的念珠菌病有满意的疗效。随着唑类药物的广泛使用，临床上对耐药菌株的报道日益多见。1978年，Holt和Azmi首先报道1例念珠菌尿路感染的患儿在连续服用9周咪康唑后，产生了对该药的抵抗。此后世界各地开始关注真菌的耐药问题，并为此开展了大量的调研工作。 到目前为止，还没有一种像细菌那样统一、规范、系统而快速的抗真菌药物敏感性实验方法，临床使用的抗真菌药物存在较大的盲目性。1982年CLSI成立了抗真菌药物试验专门委员展开研究，经过20多年的努力，多次修订，对影响实验结果的各种因素进行详细而具体的规定，形成统一规范的标准，第一次详细、规范、统一地制定了抗真菌药物敏感性实验方法，可堪称真菌史上具有划时代意思的里程碑。但是，由于其操作步骤繁琐、耗时、需要大量的人力物力，另外，唑类药物对部分念珠菌抑制生长出新拖尾现象，敏感性结果的判断较困难，具有一定的主观性。目前，仅在科研机构作为学术上的研究较多，不宜作为临床实验的常规检查，取而代之的是与微量稀释法具有较高吻合率、而操作简单、重复率高、省力快速的E−Test法[4，5，6，7]。 即便如此，CLSIM-27A仍不失为一种操作简单、消耗低廉、重复性高、达到标准化和得到各实验室广泛认可的体外抗真菌药物敏感性实验方案，本实验即采用CLSI推荐的微量液基稀释法，对45株念珠菌进行药敏测定。实验中仍出现某些念珠菌对唑类药物的拖尾现象，24h判断为敏感，而48h判断时却为耐药，处理方法参照文献,以24h的结果较为恰当。有部分菌株生长较缓慢，需48h或72h才可以看见菌落，则以48h或72h作为观察终点。每次实验都设立质控菌株（按照CLSI M27-A方案推荐），阳性生长对照和空白对照，只有当指控菌株和对照组的结果在参考范围内，试验菌株才有意义，一旦质控菌株超出质控范围，则需要重新开始试验。微量稀释法结果判断有两种方法，一是通过目测判断终点，此法相对较简单省时省事，但具有一定的主观性，同样的结果不同的人观察会有一定差异，而有的菌株对唑类药物有拖尾现象，使得终点判断更加困难，始终保持一个人固定观察结果考验减小误差；另一种方法是机测判断终点[8]，通过分光光度计或酶标仪，测定之前用微量振荡器摇匀，波长492nm阅读结果（以空白对照调零），MIC值计算：T%≥C%×TK+0.5×（100-TK%），其中T为透光率， K为空白对照透光率，将公式转化为：A≤0.301-log（1+ 10-AK）,即MIC-A。该方法客观准确，不会因认为因素而影响结果，但需要特殊设备，操作计算繁琐。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 通过对分离的大理地区阴道念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。采用美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory standards,NCCLS )推荐的微量稀释法测定念珠菌的药物敏感性.
科学性、先进性及独特之处
- 该课题实验方法在所依托实验室为成熟方法，NCCLS推荐的微量稀释法准确性和重复性好，有药物和试剂用量少、操作较简便等特点。
应用价值和现实意义
- 近年来，念珠菌感染明显升高。加上人口的老龄化、艾滋病、免疫抑制剂、广谱抗生素等药物的广泛使用。导致临床上酵母样真菌感染率逐年递增，并对抗真菌药物表现出不同程度的耐药性，给临床治疗该类疾病带来困难。通过对分离的大理地区阴道念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。
学术论文摘要
- [摘要] 目的 通过对分离的大理地区念珠菌的药物敏感性的检测，为临床抗真菌药物的选择提供依据。方法 采用微量液基稀释法，测定念珠菌对氟康唑（Fluconazole, FCZ）、酮康唑（Ketoconazole, KCZ）、5-氟胞嘧啶（5-flucytosine,5-FC）和两性霉素B（Amphotericin, AMB）共4种常用抗真菌药物的敏感性（MIC值）。结果 45株健康人群阴道念珠菌对抗真菌药物FCZ 、AMB、5-FC 、KCZ的耐药率分别为：8.9%、0%、6.7%、6.7%，敏感率分别为80%、64%、93%、84%。 结论 45株念珠菌对四种抗真菌药物的耐药率无显著性差异，敏感率除5-FC的敏感性比AMB好（P=0.001），KCZ的敏感性比AMB好（P=0.031）外，其余药物的敏感率无显著性差异（P＞0.05）。上述四种临床常用抗真菌药物可选作阴道念珠菌病的治疗，但应注意某些菌株的剂量依赖性敏感和耐药现象。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard,2nded.M27-A2.Wayne,Pa: National Committee for Clinical Laboratory Standards,2002. [2]Priscilla de Sant’Ana,Eveline Pipolo Milan,Roberto Martinez,et al.Multicenter Brazilian study of oral Candida species isolated form aids patients. Mem Inst Oswaldo Cruz,Rio de Janeiro. 2002; 97(2): 253-257. [3]董婷，魏惠永，黄革.60株酵母菌样真菌的药敏试验分析.中国抗感染化疗杂志。2005；5（4）：225-228. [4]Davey.KG, A.D.Holmes, E.M. Johnson, et al. Comparative evaluation of Fungitest and broth microdilution methods for antifungal drug susceptibility testing candida species and Cryptococcus neoformans. J.Clin.Microbiol.1988;36:926-930 [5]Willinger,B.,P.Apfalter,A.M.Hirschl,et al.Susceptibility testing of Candida species: comparison of NCCLS microdilution method with Fungitest. Diagn.Microbiol. Infect.Dis.2002;38:11-15.
同类课题研究水平概述
- 现有基础： 1、指导教师白丽教授，硕士生导师。长期从事医学微生物学与免疫学实验、教学及科研，指导大学生科研取得了良好的成果，并主持过多项云南省及国家自然科学基金项目，具有丰富的经验。曾去澳大利亚和美国学习研究多年，具有坚实的科研素养。 2、念珠菌的采集、分离和鉴定工作已经由白丽教授实验室完成，微量稀释法是较成熟的技术，为课题的顺利进行打下了坚实的基础。 3、本课题所依托的大理学院基础医学院病原生物学综合实验室是云南省示范实验室，大理学院重点实验室，已具备了完成本课题所需的全部仪器设备，能够保证课题的顺利进行。 4、本课题组成员全部来自于临床医学本科大三学生，有扎实的专业理论知识和较强的动手操作能力，是一个充满活力善于探索的团队。 研究现状： 近十年来针对真菌药物敏感性开展了多项研究,其中研究较多且较清楚的是酵母样真菌尤其是念珠菌对唑类药物的药物敏感性。许多学者对此进行了深入研究和报道。刘维达等（1996年）对52株白色念珠菌进行药敏试验，发现13.4%的菌株耐药；李季等对65例生殖器念珠菌病的分离株进行药敏检测，结果显示5-FC、KCZ、AMB、咪康唑、益康唑、制霉菌素的耐药率依次为：44.6%、9.23%、4.62%、20%、12.31%、4.62。此外，Magaldi等进行临床观察发现事先曾接受过抗真菌治疗的患者，其FCZ耐药率高达45%，而未曾接受过抗真菌治疗的患者其FCZ耐药率为10% 。 据研究报道显示目前在临床上酵母样真菌感染率逐年递增，并对抗真菌药物表现出不同程度的耐药性，成为真菌病治疗的一大难题。但不同国家和地区耐药状况有所不同,不同菌种对不同的药物耐药率也存在较大差异。大理地区健康人群阴道念珠菌药物敏感性的相关研究、报道较少，因此开展大理地区健康人群阴道念珠菌药物敏感性试验十分必要。
