基本信息
- 项目名称：
- 青蒿琥酯对胶原诱导型关节炎IL-17影响的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究以胶原诱导关节炎大鼠为模型，观察青蒿琥酯调控细胞免疫功能，抑制关节破坏的作用，通过检测T细胞活化分子CD3、CD71水平,IL-2基因表达，IL-17蛋白和基因表达，RANKL/OPG蛋白和基因表达，分析CIA关节炎症和骨质破坏情况，阐明青蒿琥酯通过抑制T细胞活化减轻关节炎症的作用机理，本课题将为揭示青蒿琥酯治疗RA的内涵提供实验依据，并拓展其治疗RA等自身免疫性疾病的临床应用。
- 详细介绍：
- 1．研究意义与目的，同类研究工作国内外研究现状与存在的问题等 1.国内外同类研究现状与存在的问题（研究背景）： 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病，其主要标志是滑膜中白细胞浸润。这种炎症过程能够刺激抗凋亡成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖，直接导致形成血管翳和关节损伤以及关节内致炎症细胞因子的表达。RA的发病率在我国约为0.4%，全球为0.5%-1.0%。该病两年致残率高达50%，患者生命普遍减少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到规范的治疗[1]，因此，开发针对类风湿关节炎的有效药物迫在眉睫。 目前临床药物中，甲氨蝶呤(methotrexate ，MTX)是最经典的一种细胞毒免疫抑制药，价格低廉，是应用范围比较广的的二线抗风湿药，起效较慢，可以延缓炎症对关节的破坏，但是不能完全阻止骨质破坏，效益/毒性欠满意，常见胃肠道反应，肝功能损害等副作用；雷公藤是一种被广泛用于治疗类风湿性关节炎的中药。研究表明，雷公藤多苷能改善大鼠佐剂性关节炎病情，但雷公藤根、茎、叶均有巨毒，临床上，可以引起消化道、血液系统、泌尿系统和神经系统的多系统不良反应；生物制剂是近年来得到研究和临床应用的治疗RA的新手段，具有特异性阻断免疫反应的特点，疗效明显，但是其价格高昂，患者难以承受，而且有发生感染和肿瘤的可能性，其治疗RA的大规模应用还有待考察[2]。 相比之下，临床多年治疗疟疾等疾病的青蒿，疗效明显，毒副作用低，过敏反应较少见，青蒿素及其衍生物已被WHO批准为在世界范围内治疗重症和氯喹抵抗疟疾的首选药物[3]。青蒿琥酯(artesuante，ART)是青蒿素的水溶性半琥珠酸酯衍生物，研究表明，除了抗疟作用外，ART还影响一系列细胞内生化过程，包括免疫调节以及抗炎、抗血管生成等，而免疫调节异常、滑膜炎症与新生血管形成在RA的发病机制中均具有重要作用[4]。张长城等[5]实验证明青蒿琥酯和甲氨蝶呤都能抑制培养的胶原诱导型关节炎大鼠滑膜细胞增生，可以阻止TNF-α，IL-1β等细胞因子的分泌；崔向军等[6]在使用泼尼松片及甲氨蝶呤的基础上联合应用青蒿琥酯治疗类风湿关节炎50例，经观察各项临床指标得到较好恢复，与羟氯喹比较疗效相当，说明青蒿琥酯对类风湿关节炎的治疗作用不亚于羟氯喹；和雅等[3]实验以牛Ⅱ型胶原诱导类风湿关节炎大鼠为模型，证明ART明显改善CIA大鼠一般情况、关节肿胀以及关节滑膜病理改变，提示青蒿琥酯对实验性RA有良好的治疗作用。临床研究表明ART对RA具有治疗作用，但其作用机制尚不清楚，目前这方面的研究国内外仍处于起步阶段。 IL-17蛋白含有155个氨基酸，分子质量为35 ku，是一个由二硫键连接的同源二聚体组成的糖蛋白，主要由外周活化的CD4+记忆性T淋巴细胞亚群和CD8+记忆性T淋巴细胞中的CD45RO+亚群受刺激后分泌。研究表明，IL-17在局部组织炎症中的作用，主要是通过诱导细胞释放前炎症因子及动员中性粒细胞的细胞因子而发挥作用[7]。 研究发现，IL-17在类风湿关节炎的病程发展中发挥着重要作用。RA患者的关节滑膜中浸润的T细胞表达IL-17，患者血清和滑膜液中的IL一17水平上升，同时伴有IL-15水平的上升。IL-17可以通过刺激滑膜细胞表达分泌角质细胞生长因子(keratinocyte grownl factor，KGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、和肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidemal growth factor-likegrowth factor，HB-EGF)等血管因子促进血管翳的形成，在RA的早期即发挥破坏作用；其能诱导滑膜细胞和软骨细胞表达金属蛋白酶，使蛋白多糖分子断裂，破坏软骨组织；同时IL-17通过对RANKL/RANK/OPG平衡系统产生影响，在骨质破坏反应中对破骨细胞的活化和骨质的吸收方面发挥着重要作用[7]。RANKL/RANK/OPG系统是近年来发现的在破骨细胞分化过程中一个重要信号传导通路，包括RANKL（Ligand of receptor activator of NF-κB），或称为破骨细胞分化因子（Osteoclast differentiation factor，ODF）；其位于破骨细胞细胞膜上的受体RANK（Receptor activator of NF-κB）和RANKL的假阳性受体骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化与骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK之间的结合，从而达到一个RANKL/RANK/OPG平衡状态。研究认为RANKL/RANK/OPG平衡与破骨过程直接相关，该平衡的打破可导致骨质的破坏，而IL-17表达水平的上升将对RANKL/RANK/OPG平衡产生影响，从而引发骨质破坏[8]。此外Kirkham等[9]对IL-1B、IL-10、IL-16、IL-17、RANKL、TNF-α、IFN-1等滑膜细胞因子能否作为RA关节损伤进展的检测指标进行了2年的前瞻性研究，发现IL-1β、IL-10、IL-17和TNF-α均可以作为关节损伤进展的检测指标，且IL-17和TNF-α呈协同作用，两者在RA发病的短期内作为检测指标效果更加理想。研究同时显示，在关节炎早期阶段，用中和性抗IL-17抗体治疗后，可以显著减轻关节炎的严重程度，X线显示关节损伤被明显抑制；组化分析也证实在使用抗IL-17抗体治疗后，关节炎症得到抑制，阻止了关节软骨和骨的进一步破坏。即使在关节炎的晚期阶段，抗IL-17抗体仍然可以显著减缓病程的发展。因此，IL-17的中和治疗可以作为RA治疗方案的辅助性治疗方法之一。有人采用抗IL-17的抗体或疫苗进行阻断治疗，也达到缓解关节炎症状、减少关节损伤的疗效。IL-17已经成为RA发病机制中非常重要的一个因素。但是目前基于IL-17的类风关机理和治疗研究国内外少见报道。 参考文献： [1]陈光星，刘良，刘清平，陈纪藩等，青藤碱对胶原诱导型关节大鼠滑膜细胞增殖及凋亡影响的研究 中华风湿病学杂志，2005；9（5） [2]张义浜,刘志敏,熊凌霜.类风湿关节炎发病机制及其治疗方法研究进展.细胞与分子免疫学杂志.2005,21(zl) [3]和雅.青蒿琥酯对实验性类风湿关节炎的治疗作用及其机制研究.中山大学硕士学位论文.2008 [4]蒋江红.青蒿琥酯的药理研究纂要.中医药学刊.2003,21(9) [5]张长城,潘蕾,崔向军.青蒿琥酯对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞增殖及TNF-α和IL-1β分泌的影响.广东医学2009,30(7):1048-1049 [6]崔向军,王燕燕,侯小强,潘蕾,付军霞.青蒿琥酯治疗类风湿关节炎临床观察.中国医院药学杂志,2007,27(5):645-646 [7]唐碧霞,唐福林.IL-17与自身免疫性疾病关系的研究进展.基础医学与临床.2008,28(1) [8]刘继中,纪宗玲,陈苏民.OPG/RANKL/RANK系统与骨破坏性疾病.生物工程学报,2003,19(6) [9]Kirkham BW Lassere MN Edmonds JP.Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis:a two-year prospective study(the damage study cohort).Arthritis and Rheumatism.2006 2.研究意义与目的 本研究以胶原诱导关节炎（CIA）大鼠为模型，观察青蒿琥酯调控细胞免疫功能，抑制关节破坏的作用，通过检测T细胞活化分子CD3、CD71水平,IL-2基因表达，IL-17蛋白和基因表达，RANKL/OPG蛋白和基因表达，系统分析CIA关节炎症和骨质破坏情况，阐明青蒿琥酯通过抑制T细胞活化及其细胞因子的产生，减轻关节炎症和关节破坏的分子免疫作用机理，本课题将为揭示青蒿琥酯治疗RA的内涵提供科学的实验依据，对拓展青蒿琥酯治疗RA等自身免疫性疾病的临床应用具有重要的意义。 2． 研究内容及工作方案 1．研究目标： 证实青蒿琥酯具有抑制关节炎症和骨质破坏的作用；阐明青蒿琥酯通过抑制T细胞活化，减少IL-17的产生，从而治疗RA等自身免疫性疾病的分子免疫机制； 2．研究内容 2.1 ART对RA的疗效，通过关节、切片等，检测CIA大鼠关节肿胀度，进行HE病理切片观察，照关节X光片，对关节破坏度做初步研究，并对比三组大鼠（MTX、ART、生理盐水）关节变化情况。 2.2 ART对RA的治疗机理，通过检测T淋巴细胞的活化度，IL-17的蛋白含量、表达，IL-17mRNA的表达以及RANKL/OPG蛋白表达，并用统计学方法，进行相关度的研究。 3、工作方案 3.1材料：牛Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂（美国Chondrex公司）。甲氨蝶呤（MTX），中国上海信宜药厂。青蒿琥酯（ART），广西桂林制药厂。无特定病原体（SPF）纯种Wistar大鼠，雄性，体重（100±20）g，饲养环境：广州中医药大学第一附属医院清洁级动物房。PCR marker（北京鼎国生物技术发展中心），RT-PCR通用试剂盒，IL-2mRNA、IL-17mRNA引物（大连宝生物工程有限公司），大鼠IL-17 ELISA试剂盒，标记抗体。 3.2 动物分组及造模 Wistar大鼠，随机分为造模组和正常对照组，造模成功后（以足肿为标志）再随机分为：造模+生理盐水组10只（造模对照组），造模+MTX组（MTX组）10只，造模+青蒿琥酯组（青蒿琥酯组）10只。造模用牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mmoL/L醋酸中，按2 g/L比例与佐剂1:1充分混合乳化，于大鼠尾根部注射（每只0.2 mL/次）。造模成功即给药，造模对照组和正常对照组按10 mL/（kg•d）以生理盐水灌胃，MTX剂量为7.6 mg/(kg•w)，青蒿琥酯用少量碳酸氢钠溶液溶解，然后用适量生理盐水稀释，经腹腔内注射给药组，本研究给药浓度为60 mg/（kg•d）。于给药后第36天断头处死动物。 3.3 足肿胀度的测量：容积法测量双后肢的足肿胀度。计分法评价四肢足肿胀度：0分：正常；1分：仅有1个趾肿；2分：2个或超过2个趾肿或一个踝关节肿胀变形；3分：全部爪肿。每只总计分0~12分。 3.4 足趾关节HE病理片的评价：取左前肢和右后肢第3足趾关节，固定、切片，HE染色，对中性粒、淋巴细胞核浆细胞浸润、滑膜细胞增生、纤维组织增生进行盲法评价。计分方法：①中性粒细胞浸润程度（急性炎症情况）：0：无浸润；+：1~5个/HP；++：6~10个/HP；+++：11~15个/HP；++++：形成小脓肿。②淋巴细胞浸润程度：0：无浸润；+：少量存在；++：稀疏散在；+++：大量存在；++++：大量细胞，并形成淋巴滤泡。③浆细胞浸润程度：0：无浸润；+：1~5 个/HP；++：6~10 个/HP；+++：11~15个/HP；++++：>16个/HP。④滑膜细胞增生程度：0：无浸润；+：肿胀增生（多）；++：增多相连；+++：增多双层；++++：3层以上。⑤滑膜纤维组织增生程度：0：无增生；+：增生占1/3 HP；++：增生占1/2 HP；+++：增生占1 HP；++++：增生>1 HP。⑥关节软骨破坏情况：0：无破坏；+：小灶状破坏<1/3；++：1/2破坏；+++：2/3 破坏；++++：全部破坏。 3.5 四肢关节X光片：每只大鼠的足趾和踝关节破坏分骨侵蚀（erosion）和关节间隙改变（Joint space narrowing,JSN）两个方面进行评价。骨侵蚀评分标准：0：正常；1：可疑或有一个微小局部病灶；2:2个局部病灶或病灶总面积≤50%；3:3个以上的病灶或病灶总表面积＞50%；4：关节面完全破坏，或出现骨缩小。关节间隙：0：正常；1：可疑或有一个微小局部病灶；2：关节出现狭窄；3：关节强直或关节间隙增宽。骨侵蚀共96块骨，关节间隙共100个。由影像学医生盲法阅片后评分。 3.6 活化T淋巴细胞检测：取肠系膜淋巴结，用流式细胞术检测T淋巴细胞活化CD3、CD71水平，用RT-PCR检测IL-2mRNA表达水平。 3.7大鼠血清IL-17的检测：将大鼠断头取血，按照ELISA试剂盒说明书进行，检测IL-17的蛋白含量；用RT-PCR检测IL-17mRNA的表达水平；取滑膜、关节，用免疫组化检测IL-17的蛋白表达水平。 3.8 RANKL/RANK/OPG蛋白和基因表达检测：用免疫组化检测RANKL/OPG蛋白表达水平，用RT-PCR检测RANKL/RANK/OPG mRNA表达水平。 3.9统计学方法：所有数据全部录入计算机，采用SPSS 15.0 统计软件进行统计学处理。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 类风湿关节炎两年致残率高达50%，患者生命普遍减少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到规范的治疗，开发针对类风湿关节炎的有效药物迫在眉睫。本研究基本思路是以胶原诱导关节炎大鼠为模型，观察青蒿琥酯调控细胞免疫功能、抑制关节破坏的作用，阐明青蒿琥酯减轻关节炎症和关节破坏的分子免疫作用机理。
科学性、先进性及独特之处
- 1 青蒿琥酯(ART)在治疗疟疾方面取得了较好的疗效，除了抗疟作用外，临床研究表明ART对RA具有治疗作用，但其作用机制尚不清楚，目前这方面的研究国内外还比较少见。 2 本课题主要从T细胞活化及其产生的细胞因子IL-17入手，研究其抗炎、抗骨质破坏的作用机制，目前在国内外未见报道。
应用价值和现实意义
- 本课题将为揭示青蒿琥酯治疗RA的内涵提供科学的实验依据，对拓展青蒿琥酯治疗RA等自身免疫性疾病的临床应用具有重要的意义。
学术论文摘要
- 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性多关节滑膜炎、骨及软骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病，其主要标志是滑膜中白细胞浸润。这种炎症过程能够刺激抗凋亡成纤维样滑膜细胞（FLS）的增殖，直接导致形成血管翳和关节损伤以及关节内致炎症细胞因子的表达。RA的发病率在我国约为0.4%，全球为0.5%-1.0%。该病两年致残率高达50%，患者生命普遍减少5到10年，致死率高，且每年有大量的患者未得到规范的治疗[1]，因此，开发针对类风湿关节炎的有效药物迫在眉睫。
获奖情况
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鉴定结果
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参考文献
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同类课题研究水平概述
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