基本信息
- 项目名称：
- 东北高山地区苏云金芽孢杆菌的分离及其cry基因克隆
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 生物杀虫剂是一类新型的绿色杀虫剂，我国物产富饶，菌种资源丰富。尤其是以东北地区的黑土地菌种资源更是分布庞大，苏云金芽孢杆菌出土率较高，且地区之间差异较大，比较容易分出多种不同的杀虫蛋白。正是如此我们采集了密山、绥化、丹东、五指山地区的土样。通过鉴定起基因型，以研究东北高山地区苏云金芽孢杆菌的分布。
- 详细介绍：
- 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一类分布广泛并能产生多种杀虫蛋白的革兰氏阳性细菌，很多国家都投入大量资金研究其在农业上的应用。不少杀虫基因都已被大量表达并且应用于新型的生物农药，从根本上解决了传统化学农药污染环境和害虫产生抗药性的问题。我国物产富饶，菌种资源丰富。尤其是以东北地区的黑土地菌种资源更是分布庞大，苏云金芽孢杆菌出土率较高，且地区之间差异较大，比较容易分出多种不同的杀虫蛋白。 正是如此我们采集了密山、绥化、丹东、五指山地区的土样。通过4%的氯化钠培养液振荡培养法、高温筛选法和油镜镜检综合法，分离了每个地区的苏云金芽孢杆菌菌株若干，并在油镜下观察了每个菌株形成的伴孢晶体蛋白。使用通用引物进行PCR，鉴定其cry基因类型。 最终我们采集土样共计70份，分离的苏云金芽孢杆菌35株，在油镜下观察到伴孢晶体类型有菱形、球形、方形、以及晶体与芽孢粘连的特殊类型。通过PCR分析鉴定，含有cry1型基因的菌株1株，含有cry3型基因的菌株2株。进行苏云金芽孢杆菌全基因序列的克隆与表达，测定了一株含cry3高效杀虫蛋白的全基因碱基序列、氨基酸序列。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 生物杀虫剂是一类新型的绿色杀虫剂，我国物产富饶，菌种资源丰富。尤其是以东北地区的黑土地菌种资源更是分布庞大，苏云金芽孢杆菌出土率较高，且地区之间差异较大，比较容易分出多种不同的杀虫蛋白。正是如此我们采集了密山、绥化、丹东、五指山地区的土样。通过鉴定起基因型，以研究东北高山地区苏云金芽孢杆菌的分布。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究采用温度筛选方法筛选菌株，采用4%的氯化钠培养液振荡培养，有效地抑制Bt孢子的萌发。通过石炭酸复红染色镜检初步鉴定，并结合晶体形态伴孢晶体的鉴定苏云金杆菌。对Bt分离菌株的cry基因进行PCR-RFLP鉴定，及苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的SDS-PAGE分析。
应用价值和现实意义
- 应用化学合成制剂控制害虫，虽然在大多数情况下是有效的,但是化学药物有很多负面影响,如容易使第二代昆虫产生抗药性,对其他物种的毒害,环境污染,农产品和动物中有残留.。本研究的鉴定方法对苏云金芽孢杆菌的资源分布，高效筛选优良和含有新型基因的菌株，以及基因克隆、构建工程菌并对获得抗虫转基因植物具有十分重要的理论和实践意义。
学术论文摘要
- 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一类分布广泛并能产生多种杀虫蛋白的革兰氏阳性细菌。不少杀虫基因都已被大量表达并且应用于新型的生物农药，从根本上解决了传统化学农药污染环境和害虫产生抗药性的问题。我国物产富饶，菌种资源丰富。尤其是以东北地区的黑土地菌种资源更是分布庞大，苏云金芽孢杆菌出土率较高，且地区之间差异较大，比较容易分出多种不同的杀虫蛋白。 正是如此我们采集了密山、绥化、丹东、海南五指山地区的土样。通过4%的氯化钠培养液振荡培养法、高温筛选法和油镜镜检综合法，分离了每个地区的苏云金芽孢杆菌菌株若干，并在油镜下观察了每个菌株形成的伴孢晶体蛋白。使用通用引物进行PCR，鉴定其cry基因类型。 最终我们采集土样共计70份，分离的苏云金芽孢杆菌35株，在油镜下观察到伴孢晶体类型有菱形、球形、方形、以及晶体与芽孢粘连的特殊类型。通过PCR分析鉴定，含有cry1型基因的菌株1株，含有cry3型基因的菌株2株。进行苏云金芽孢杆菌全基因序列的克隆与表达，测定了一株含cry3高效杀虫蛋白的全基因碱基序列、氨基酸序列。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 情况属实
参考文献
- 2004年9月11日，美国能源部的Brettin等在NCBI上公布了一株名为97-27的苏云金芽孢杆菌的基因组全序列，标志着人类对Bt由单个基因研究向基因组研究时代的开始。 2005年，罗兰，谢丙炎等（罗兰，谢丙炎 2005）曾从我国20个省市采集176份土壤中分离出苏云金芽孢杆菌51株. 以cry1, cry2, cry3, cry4, cry - n, cry7, cry8,cry11, cry13和cyt的引物作PCR分析.对我国苏云金芽孢杆菌菌种资源的分布做了一个较为详细的调查。 2008年，张灵玲，关怡等对武夷山的5 份土壤样本进行苏云金芽孢杆菌菌株的分离,获得2 株编号分别为QQ3 和QQ17的Bt 新菌株。并做了生物活性测试，发现QQ17 对白纹伊蚊有很高的杀虫活性,校正死亡率达95.6%，使生物杀蚊剂的开发研制成为了可能（张灵玲，关怡， 2008）。同年，张灵玲，张永嵘等对生物农药Bt资源库进行了初步构建并研究了Bt菌株的形态学和生理生化特性,以及相关菌株的基因情况（张灵玲，张永嵘， 2008）。为保护有益生物菌株和生物农药的研制做出了重要贡献。
同类课题研究水平概述
- 1901年日本学者S.Ishiwata从猝倒死亡的家蚕体内分离出一种杆状细菌，即Bt猝倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp. scotto)，从而揭开了人类对苏云金芽孢杆菌的研究史（Ishiwata S，1901）。 1911年Berliner报道了从德国苏云金省染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌并定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)（Berliner E，1911）。 1938年，第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂问世，用于防治地中海粉螟。到1953年Hannay第一次发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并与Fitz-James一起证实了伴孢晶体是一种蛋白质（Hannay C L，1953; Hannay C L et al，1955）。Dulmage（1970）筛选出对夜蛾科毒力较高的菌株HD-1，并以此建立了标准品的生物测定程序，实现了苏云金芽孢杆菌制剂的标准化（Dulmage H T，1970）。 1995年Crickmore等提出了新的cry基因分类系统，目前确定并公布的杀虫基因已达325种。（截至2005年1月）（）。 2005年，罗兰，谢丙炎等（罗兰，谢丙炎 2005）曾从我国20个省市采集176份土壤中分离出苏云金芽孢杆菌51株. 以cry1, cry2, cry3, cry4, cry - n, cry7, cry8,cry11, cry13和cyt的引物作PCR分析.对我国苏云金芽孢杆菌菌种资源的分布做了一个较为详细的调查。 2008年，张灵玲，关怡等对武夷山的5 份土壤样本进行苏云金芽孢杆菌菌株的分离,获得2 株编号分别为QQ3 和QQ17的Bt 新菌株。并做了生物活性测试，发现QQ17 对白纹伊蚊有很高的杀虫活性,校正死亡率达95.6%，使生物杀蚊剂的开发研制成为了可能（张灵玲，关怡， 2008）。同年，张灵玲，张永嵘等对生物农药Bt资源库进行了初步构建并研究了Bt菌株的形态学和生理生化特性,以及相关菌株的基因情况（张灵玲，张永嵘， 2008）。为保护有益生物菌株和生物农药的研制做出了重要贡献。
