基本信息
- 项目名称：
- 肺炎链球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突变与β-内酰胺类耐药相关性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 肺炎链球菌是重要的人类病原菌之一，全球每年死于肺炎链球菌感染约有300~500 万人。β-内酰胺类抗生素是临床上治疗该菌感染的一线药物。耐药性不断增强和耐药株的流行是该菌所致疾病发病率不断升高的根本原因。浙医高专胡瑜洁同学在孙爱华教授指导下研究肺炎链球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性，为研究细菌耐药分子机制、筛选药物新靶标及抗耐药新药的研制提供依据。
- 详细介绍：
- 肺炎链球菌是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起细菌性脑膜炎、中耳炎等疾病。近年来，肺炎链球菌感染性疾病的发病率一直居高不下，全球死于肺炎链球菌感染的人数接近结核病，每年约为300~500 万人。众所周知，β-内酰胺类抗生素是临床上治疗肺炎链球菌等革兰阳性菌感染性疾病的一线药物。例如，近年来日本、韩国等周边国家耐药菌株分离率高达30%-70%，北美和欧洲耐药菌株分离率也可达35%-50%。因此，肺炎链球菌是重要的人类病原菌之一，深入研究该菌对β-内酰胺类抗生素耐药的分子机制，不仅能更深入地认知细菌耐药性，同时也可为筛选药物新靶标、研制抗耐药新药提供线索和依据。 一般认为，细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的机制主要有产生β-内酰胺酶、外膜通透性下降使药物摄取量减少、青霉素结合蛋白突变等。但肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，革兰阳性菌无外膜，因而膜通透性改变对肺炎链球菌耐药关系不大。目前国外学者对PBPs突变引起的肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药性机制有较多研究，认为肺炎链球菌临床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因PBD或附近序列突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性且有地区差异，我国学者对肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药的流行病学调查进行得较多，但对肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药性机制研究多局限于对某一个PBP编码基因点突变与耐药的关系，为确定本省耐β-内酰胺类抗生素肺炎链球菌与PBPs突变基因多位点累积相关性，我们研究了36例肺炎链球菌临床菌株发现： 4株PSSP、9株PISP及16株PRSP菌株PBP2B中SSN的C端T445A/S突变，其余6株PSSP和1株PISP菌株无突变。MIC≥0.5 mg/L的7株PISP及16株PRSP菌株PBP2X中STMK出现T338A突变、KSG的N端出现L546V突变，2株PISP菌株SSN的N端分别出现H394Y/L突变，另有2株高度耐药PRSP菌株STMK的C端发生M342I突变。所有36株菌株PBP1A的SRN和KTG、10株PSSP菌株STMK序列均未发生突变，所有MIC≥1 mg/L 的PISP和PRSP菌株PBP1A的STMK均出现T371A/S突变、SRN的C端出现P432T突变。其中多个突变是未见相关报道。我们选择了肺炎链球菌PBP2B、PBP2X和PBP1A三个编码基因多位点突变与β-内酰胺类抗生素耐药相关性进行探讨，为进一步阐明肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药新机制奠定基础。研究内容紧跟国际，部分领先国内，具有重要的学术价值。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：探讨SP临床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因编码的PBPs的PBD中SVVK、SSN和KTG基序及邻近序列的突变与β-内酰胺类抗生素耐药相关性。基本思路：采用二倍稀释法检测36株菌株对4种β-内酰胺类抗生素的MIC。采用PCR扩增各菌株DNA中pbp2B、pbp2X和pbp1A基因片段并测序。根据药敏试验及测序结果，分析上述基因PBD或附近序列突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：利用分子生物学手段检测了肺炎链球菌临床菌株基因突变并与直接测序和药敏试验对比。先进性：基因与耐药的相关性是近年对临床药物耐药机制研究的新方法，肺炎链球菌临床菌基因突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性研究的报道不多见。独特之处：国外文献报道，肺炎链球菌临床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因PBD或附近序列突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性且有地区差异。
应用价值和现实意义
- 肺炎链球菌是重要的人类病原菌之一，全球每年死于肺炎链球菌感染约有400万人。β-内酰胺类抗生素是临床上治疗该菌感染的一线药物。耐药性不断增强和耐药株的流行是该菌所致疾病发病率不断升高的根本原因。近年来我国耐药菌株分离率升至25%-60%研究肺炎链球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突变与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性，为研究细菌耐药分子机制、筛选药物新靶标及抗耐药新药的研制提供依据
学术论文摘要
- 目的：探讨肺炎链球菌临床菌株pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突变与β-内酰胺类抗生素耐药相关性。方法：采用二倍稀释法检测36株肺炎链球菌临床菌株对4种β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度。采用PCR扩增各基因片段并测序。结果：36株肺炎链球菌临床菌株中，10株为PSSP、10株为PISP、16株为PRSP。4株PSSP、9株PISP及16株PRSP菌株PBP2B中SSN的C端T445A/S突变，其余6株PSSP和1株PISP菌株无突变。MIC≥0.5 mg/L的7株PISP及16株PRSP菌株PBP2X中STMK出现T338A突变、KSG的N端出现L546V突变，2株PISP菌株SSN的N端分别出现H394Y/L突变，另有2株高度耐药PRSP菌株STMK的C端发生M342I突变。所有36株菌株PBP1A的SRN和KTG、10株PSSP菌株STMK序列均未发生突变，所有MIC≥1 mg/L 的PISP和PRSP菌株PBP1A的STMK均出现T371A/S突变、SRN的C端出现P432T突变。结论：肺炎链球菌pbp2B、pbp2X和pbp1A基因突变与β-内酰胺类耐药相关
获奖情况
- 本论文发表于《浙江医学高等专科学校学报》2010年第三期； 已被《中国卫生检验杂志》录用。
鉴定结果
- 本项目需作进一步深入研究，目前尚无相关结论性鉴定结果
参考文献
- 现有技术： 目的基因的PCR扩增：利用PCR扩增各菌株DNA中pbp2B、pbp2X和pbp1A基因片段。目的DNA片段测序：将上述目的DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA 聚合酶催化下进行延伸反应。同时，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种dNTP底物，其中一种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。 文献检索目录： ［1］Chesnel L, Carapito R, Croizé J, et al. Identical penicillin-binding domains in penicillin-binding proteins of Streptococcus pneumoniae clinical isolates with different levels of β-lactam resistance [J]. ［2］Izdebski R, Rutschmann J, Fiett J, et al. Highly variable penicillin resistance determinants PBP 2x, PBP 2b, and PBP 1a in isolates of two Streptococcus pneumoniae clonal groups, Poland23F-16 and Poland6B-20 [J]. ［3］Cafini1 F, del Campo R, Alou L, et al. Alterations of the penicillin-binding proteins and murM alleles of clinical Streptococcus pneumoniae isolates with high-level resistance to amoxicillin in Spain[J]. ［4］Hoskins JA, Alborn WJ, Arnold J, et al. Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6 [J].
同类课题研究水平概述
- 细菌耐药性不断增强及耐药性细菌日趋流行，严重威胁着人类健康和生命安全，成为当前全人类共同面临的重大医学问题之一。例如，最近英国、日本、印度等国家发现的高耐药超级细菌（表达NDM-1 β-内酰胺酶的肠道杆菌）感染性疾病，已成为全球瞩目的焦点。 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起细菌性脑膜炎、中耳炎等疾病。近年来，肺炎链球菌感染性疾病的发病率一直居高不下，全球死于肺炎链球菌感染的人数接近结核病，每年约为300~500 万人。众所周知，β-内酰胺类抗生素是临床上治疗肺炎链球菌等革兰阳性菌感染性疾病的一线药物。业已肯定，肺炎链球菌对β-内酰胺类药物耐药性不断增强及耐药菌株广泛流行，是该菌所致疾病发病率不断升高的根本原因。例如，我国β-内酰胺类抗生素耐药肺炎链球菌临床菌株分离率，已从10年前的2%-5%上升至近年的25%-60.0%；近年来日本、韩国等周边国家耐药菌株分离率高达30%-70%[5]，北美和欧洲耐药菌株分离率也可达35%-50%。因此，肺炎链球菌是重要的人类病原菌之一，深入研究该菌对β-内酰胺类抗生素耐药的分子机制，不仅能更深入地认知细菌耐药性，同时也可为筛选药物新靶标、研制抗耐药新药提供线索和依据。 一般认为，细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的机制主要有产生β-内酰胺酶、外膜通透性下降使药物摄取量减少、青霉素结合蛋白突变等。但肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，革兰阳性菌无外膜，因而膜通透性改变对肺炎链球菌耐药关系不大。目前国外学者对PBPs突变引起的肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药性机制有较多研究，我国学者对肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药的流行病学调查进行得较多，但对肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药性机制研究多局限于对某一个PBP编码基因点突变与耐药的关系，我们阅读国外文献发现肺炎链球菌PBPs突变往往是通过多基因多位点累积突变逐步增加对抗生素的耐药性而且不同国家与地区差异较大。为确定本省耐β-内酰胺类抗生素肺炎链球菌与PBPs突变基因多位点累积相关性，我们选择了PBP2B、PBP2X和PBP1A三个编码基因多位点与肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药进行探讨，为进一步阐明肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素耐药新机制奠定基础。研究内容紧跟国际，部分领先国内，具有重要的学术价值。
