基本信息
- 项目名称：
- T载体的高效制备
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 大肠杆菌质粒DNA的提取质粒是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，且实验制备不易，目前大多数实验室都是向生物技术公司采购，但价格高、不能满足现用现制，所以找到一中能够大量制备T载体的方式、方法对于现如今的实验室来说非常关键。本实验的目的意义就在于为实验室制备成本廉价、使用方便、效率高的T载体。
- 详细介绍：
- T载体是一种用于直接克隆PCR产物的新型载体，其分子末端各有一个3’dT(脱氧胸苷)突出，恰好可与PCR产物末端由于taq DNA聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的dA(脱氧腺苷)互补配对，这样可将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上．利用T载体进行PCR产物克隆的方法称为TA克隆。TA克隆是一种快速的，一步到位的克隆法，可以把PCR产物直接插入到质粒载体中．这种方式不仅克服了常规方法的缺点而且操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广泛．T载体按照功能可分为克隆型T载体与表达型T载体，目前市场上供应的T载体主要是克隆型T载体，具有克隆目的基因的功能，仅满足基因保存和测序的需要．若要表达目的基因，还需要将目的基因重组至表达载体中。而表达型T载体具有克隆目的基因和表达目的基因的功能，还具有其他独特优势，但其构建还存在一些难点。 本实验旨在于参考众多的方法，优化处一种适合于实验室制备T载体，简单，高效，高质量的T载体制备方法。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 寻求一种简单、高效、高质量的T载体的高效制备的方法。
科学性、先进性及独特之处
- T载体的制备方法简单化，提取效率高，T载体的纯度高。
应用价值和现实意义
- T载体是实验室常用的载体之一，需求量大，通过本方法可以为实验室节约成本，也可商品化。
学术论文摘要
- T载体是直接克隆或表达PCR产物的载体，重组过程无需酶切和纯化，简便高效。在总结国内外研究的基础上，概述了构建T载体的方法，其中内切酶法是T载体制备方法中较先进的方式．阐述了T载体在抗体库构建、目的基因克隆、某些蛋白的融合表达方面的应用以及目前T载体的商业化．对表达型T载体与克隆型T载体进行了比较，其中表达型T载体可以同时满足基因克隆和表达的需要，还具有其他独特的优势。介绍了表达型T载体的构建难点，探讨了今后T载体的研究发展方向．本实验的T载体是用E.coli JM109的pblue sriptⅡ质粒酶切后加T反应得到的，这个质粒上带有具有氨苄抗性的一段基因，所以在做做完转化时可以用氨苄培养基作为第一步的筛选，这也是本实验的一个创新之处。
获奖情况
- 东北农业大学大学生优秀科创论文
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 贾翠娟,董兆麟.一种自制T-载体的构建[J].微生物学通报,2001,28(5):56-60. [2] 陆哲明,柯杨.用限制性内切酶制备T载体[J].北京大学学报,2002,3(6):726-728. [3] 雷黎.T载体在Fab段噬菌体抗体库构建中的应用[J].现代检验医学杂志,2006,21(6):33-35. [4] 云妙英,王涛,张京文,等.人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建[J].中央民族大学学报:自然科学版,2008,17(2):48-51. [5] 吴燕峰,王鹏,唐勇.大鼠脑源性神经营养因子基因T载体的构建及鉴定[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,l6(4):291-295. [6] OUYANG Danming, HU Yongxuan, LI Mulan, et al. Con-struction of eukaryotic expression vector encoding ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Sj and its expression in HeLa cells[J]. Journal of Medical Colleges of PLA,2008,23(2):94-97. [7] 张彤,秦东春,张光磊,等.T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究[J].河南医科大学学报,1998,33(1):56-59.
同类课题研究水平概述
- 目前来说，T载体应用广泛，但是大多数实验室是采用生物技术公司所研制的产品，以下是一些国内的研究境况和专利申请。 2004年06月10日申请的一项发明公开了一种制备Ｔ载体的方法，其目的是提供一种制备具有较高TA克隆效率的Ｔ载体。此发明的制备Ｔ载体的方法，包括以下步骤：1)制备含有XcmＩ盒或AhdＩ盒的前Ｔ载体；所述XcmＩ盒包括间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个XcmＩ酶切位点序列，所述AhdＩ盒包括所述间隔DNA序列、紧密连接于所述间隔ＤＮＡ序列两侧的各一个AhdＩ酶切位点序列；2)用XcmＩ或XcmＩ的同裂酶，或AhdＩ或AhdＩ的同裂酶酶切步骤１）中的前Ｔ载体，得到Ｔ载体；其中，所述步骤1)中的间隔DNA序列为cccdB基因序列。本发明的制备Ｔ载体的方法将在基因工程领域中发挥重要作用。
